Задача 3 кл: Задачи по математике 4 класс

Урок по математике. 3 класс. “Решение задач. Закрепление.”

Урок по математике. 3 класс. “Решение задач. Закрепление.”

 

Тема урока: Решение задач. Закрепление.

Цель урока:

Образовательная: закреплять навыки решения задач, примеров.

Развивающая: развивать умение наблюдать, выделять главное, анализировать, обобщать,; развивать внимание, логическое мышление; развивать математическую речь, память; развивать познавательную активность.

Воспитательная: воспитывать доброжелательность, взаимопомощь

Планируемые результаты – предметные и метапредметные, на формирование которых направлена работа на данном уроке:

• Личностные универсальные учебные действия: учебно-познавательный интерес к учебному материалу; способность к самооценке;
• Регулятивные: планировать свои действия в соответствии с поставленной задачей; различать способ и результат действия; проявлять познавательную инициативу в учебном сотрудничестве;
• Познавательные: осознанно строить устное высказывание в устной форме; строить логическое рассуждение; произвольно и осознанно владеть общим приёмом решения задачи; ориентироваться на разнообразие способов решения задачи;
• Коммуникативные: договариваться и приходить к общему решению в совместной деятельности; задавать вопросы; осуществлять взаимный контроль.

Метопредметная связь – русский язык, литературное чтение, окружающий мир

Задачи:

·        закрепить навыки решения задач на деление и умножение, решение примеров;

·        учить выделять главное и второстепенное, развивать мыслительную деятельность, внимание, речь;

·         формировать интерес к математике, расширять математический кругозор.

Тип урока:

– урок – повторения предметных знаний. 

 Методы обучения: проблемно-диалогическая и личностно ориентированная технология обучения.

Формы организации познавательной деятельности учащихся:

– фронтальная;

– индивидуальная;

– самостоятельная.

 

Ход урока.

1. Организационный момент.

– Доброе утро, ребята и уважаемые гости!

Я очень рада встрече с вами.

Надеюсь, что сегодняшний урок принесет нам радость общения друг с другом.

Пожалуйста, садитесь!

 

2. Мотивация и актуализация опорных знаний.

Давайте, ребята, учиться считать,

Делить, умножать, прибавлять, вычитать.

Запомните все, что без устного счёта.

Не сдвинете с места любая работа.

Устный счёт.

 

– Назовите тир числа, которые в сумме дают число, записанное в скобках.

35, 18, 21, 17, 19 (73) (35+21+17=73)

44, 10, 12, 36, 40 (86) (10+36+40=86)

35,27,28, 26, 30 (90) (35+27+28=90)

– Следующее задание. Вычислите устно, записывая только ответы

• Из числа 65 вычесть 17 (48)
• Разность чисел 47 и 34 увеличить на 8 (21)
• На сколько нужно увеличить 43, чтобы получилось 80? (на 37)
• Найдите произведение чисел 7 и 8 (56)
• Во сколько раз 42 больше 7? (в 6 раз)

 

– Задание на внимательность. На парте у каждого есть листочек, в нём много чисел.

Эти числа являются результатами таблицы умножения, но есть и лишние. Ваша задача зачеркнуть лишние числа.

28

31

83

26

54

45

42

59

49

32

18

36

11

21

15

72

14

62

30

27

 

На что похожа получившаяся фигура? (буква Т)

Почему? (таблица умножения)

 

3 Определение темы урока.

Готовясь к встрече с вами и к сегодняшнему уроку математики, я натолкнулась на такое стихотворение:

Хоть ты смейся, хоть ты плачь,

Не люблю решать задач.

Потому что нет удачи

На проклятые задачи.

Может быть, учебник скверный,

Может быть, таланта нет,

Не могу открыть секрет:

Как задаче дать ответ…

– Итак, в какую область математики мы отправляемся?

4. Работа по теме урока.

1. На озере плавало 36 уток, а гусей на 27 меньше. Во сколько раз уток больше, чем гусей? 

Уток _ 
Гусей _ 
Во сколько раз больше? 
1) 36 – 27 = 9 (шт.) гусей на озере 
2) 36 : 9 = 4 (раза) уток больше, чем гусей
Ответ: в 4 раза.

 

2. Составьте задачу по таблице.

На один костюм

Количество костюмов

Всего ткани

?

6 шт.

30 м

одинаковый

8 шт.

?

 

Запишите решение и ответ.

5. Физкультминутка.

Руки на пояс поставьте вначале,

Влево и вправо качайте плечами.

Вы дотянитесь мизинцем до пятки.

Если сумели, всё в полном порядке.

 

7. Подведение итогов урока.

Над какой темой работали на уроке?

Какая задача вам показалась самой трудной?

8. Рефлексия.

Ребята, на партах у вас лежат мордашки. Определите свою успешность на уроке:

Я работал на уроке с желанием. Мне было интересно и понятно. Улыбка

Я работал на уроке с желанием, но не очень уверенно, чувствовал какое-то неудобство, волновался. Прямая черточка

Я работал на уроке без желания, боялся отвечать и выполнять работу. Грустная дуга.

 

задания по неорганической и органической химии. Задачи 34 и 33

Вариант 1 34 задания

Вариант 2 34 задания

Вариант 3 34 задания

Вариант 4 34 задания

Вариант 5 34 задания

Вариант 6 34 задания

Вариант 7 34 задания

Вариант 8 34 задания

Вариант 9 34 задания

Вариант 10 34 задания

Вопрос №1 ЕГЭ. Строение атома 66 заданий

Вопрос №2 ЕГЭ. Периодический закон 60 заданий

Вопрос №3 ЕГЭ. Валентность и степень окисления 42 задания

Вопрос №4 ЕГЭ. Химическая связь и кристаллические решетки 59 заданий

Вопрос №5 ЕГЭ. Классификация неорганических веществ (формат 2021) 49 заданий

Свойства оксидов и простых веществ 60 заданий

Вопрос №6 ЕГЭ. Свойства солей, кислот, оснований, амфотерных гидроксидов. РИО 50 заданий

Вопрос №7 ЕГЭ. Свойства неорганических веществ 80 заданий

Вопрос №8 ЕГЭ. Свойства неорганических веществ. 50 заданий

Вопрос №9 ЕГЭ. Превращения неорганических веществ 50 заданий

Вопрос №17 ЕГЭ. Классификация химических реакций. 77 заданий

Вопрос №18 ЕГЭ. Скорость химической реакции 40 заданий

Вопрос №19 ЕГЭ. Окислительно-восстановительные реакции. 45 заданий

Электролиз (формат 2021) 40 заданий

Вопрос №21 ЕГЭ. Гидролиз солей, среда водных растворов веществ 28 заданий

Гидролиз солей, среда водных растворов (формат 2021) 40 заданий

Вопрос №22 ЕГЭ. Химическое равновесие. 32 задания

Вопрос №24 ЕГЭ. Качественные реакции, распознавание веществ. 60 заданий

Вопрос №25 ЕГЭ. Производство и применение веществ. Полимеры 100 заданий

Вопрос №26 ЕГЭ. Задачи на растворы 39 заданий

Вопрос №27 ЕГЭ. Задачи на ТХУ и объемные отношения газов 27 заданий

Задачи на расчет по уравнению реакции (формат 2021) 25 заданий

Вопрос №29 ЕГЭ. Окислительно-восстановительные реакции. 55 заданий

Вопрос №30 ЕГЭ. Реакции ионного обмена 55 заданий

Вопрос №31 ЕГЭ. Реакции с участием неорганических веществ 32 задания

Вопрос №23. Расчетная задача на химическое равновесие 20 заданий

Тест «Алканы 2.0» 44 задания

Цепочки «Алканы» 10 заданий

Тест «Алкены» 30 заданий

Цепочки «Алкены» 10 заданий

Тест «Циклы и алкадиены» 30 заданий

Цепочки «Циклы и алкадиены» 10 заданий

Цепочки «Алкины» 10 заданий

Тест «Арены 2. 0» 61 задание

Цепочки «Арены» 10 заданий

Тест «Спирты и фенол» 30 заданий

Цепочки «Спирты и фенолы» 10 заданий

Цепочки «Альдегиды и кетоны» 10 заданий

Сложные эфиры 60 заданий

Карточки с похожими реакциями 37 заданий

Вопрос №11 ЕГЭ. Строение органических веществ. Изомеры и гомологи. 60 заданий

Свойства и способы получения углеводородов 70 заданий

Свойства и способы получения кислородсодержащих органических веществ 60 заданий

Вопрос №13 ЕГЭ. Азотсодержащие вещества, углеводы, жиры 65 заданий

Вопрос №14 ЕГЭ. Свойства углеводородов 40 заданий

Вопрос №34 ЕГЭ. Вывод формулы органического вещества 29 заданий

Линия 1. Строение атома 55 заданий

Линия 2. Периодический закон 56 заданий

Линия 3. Валентность и степень окисления. 55 заданий

Линия 4. Типы химических связей, кристаллические решетки. 56 заданий

Линия 10. Классификация и номенклатура органических веществ 92 задания

Линия 11. Строение органических веществ, изомеры, гомологи. 92 задания

Линия 13. Азотсодержащие вещества, жиры, углеводы. 103 задания

Линия 14. Превращения углеводородов 48 заданий

Линия 15. Превращения кислородсодержащих веществ 49 заданий

Атомистика, мольные отношения, изменение концентрации растворенного вещеcтва 31 задание

Задачи на растворы 20 заданий

Турнир Городов – задачи

Задачи всех Турниров Городов

Мы постарались найти в данном тексте все опечатки, исправить все ошибки и правильно указать авторов всех задач. Если Вы найдёте ещё – убедительная просьба сообщить по электронной почте по адресу Также просьба сообщать Ваши замечания и предложения.

Нумерация классов соответствует времени проведения Турнира.

• Сорок третий Турнир городов, 2021-2022
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 10 октября 2021 г.
    • сложный вариант, 24 октября 2021 г.
    • решения и критерии проверки
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 6 марта 2022 г.
    • сложный вариант, 20 марта 2022 г.
    • решения задач
  • Устный тур 3 апреля 2022 г., предварительные решения

• Сорок второй Турнир городов, 2020-2021
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 11 октября 2020 г.
    • сложный вариант, 25 октября 2020 г.
    • решения задач
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 14 марта 2021 г.
    • сложный вариант, 28 марта 2021 г.
    • решения задач
  • Устный тур 25 апреля 2021 г., решения

• Сорок первый Турнир городов, 2019-2020
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 13 октября 2019 г.
    • сложный вариант, 27 октября 2019 г.
    • решения задач
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 16 февраля 2020 г.
    • сложный вариант, 1 марта 2020 г.
    • решения задач
  • Устный тур 15 марта 2020 г., предварительные решения

• Сороковой Турнир городов, 2018-2019
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 7 октября 2018 г.
    • сложный вариант, 21 октября 2018 г.
    • решения задач
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 3 марта 2019 г.
    • сложный вариант, 17 марта 2019 г.
    • решения задач
  • Устный тур 24 марта 2019 г., решения

• Тридцать девятый Турнир Городов, 2017-2018
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 8 октября 2017 г.
    • сложный вариант, 22 октября 2017 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 25 февраля 2018 г.
    • сложный вариант, 11 марта 2018 г.
  • Устный тур 25 марта 2018 г., решения

• Тридцать восьмой Турнир Городов, 2016-2017
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 9 октября 2016 г.
    • сложный вариант, 23 октября 2016 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 26 февраля 2017 г.
    • сложный вариант, 12 марта 2017 г.
  • Устный тур 19 марта 2017 г., предварительные решения

• Тридцать седьмой Турнир Городов, 2015-2016
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 11 октября 2015 г.
    • сложный вариант, 25 октября 2015 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 28 февраля 2016 г.
    • сложный вариант, 13 марта 2016 г.
  • Устный тур 20 марта 2016 г., решения

• Тридцать шестой Турнир Городов, 2014-2015
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 12 октября 2014 г.
    • сложный вариант, 26 октября 2014 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 1 марта 2015 г.
    • сложный вариант, 15 марта 2015 г.
  • Устный тур 22 марта 2015 г., решения

• Тридцать пятый Турнир Городов, 2013-2014
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 13 октября 2013 г.
    • сложный вариант, 27 октября 2013 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 16 февраля 2014 г.
    • сложный вариант, 2 марта 2014 г.
  • Устный тур 10 марта 2014 г., решения

• Тридцать четвертый Турнир Городов, 2012-2013
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 7 октября 2012 г.
    • сложный вариант, 21 октября 2012 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 24 февраля 2013 г.
    • сложный вариант, 10 марта 2013 г.
  • Устный тур 14 марта 2013 г. , решения

• Тридцать третий Турнир Городов, 2011-2012
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 9 октября 2011 г.
    • сложный вариант, 23 октября 2011 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 26 февраля 2012 г.
    • сложный вариант, 18 марта 2012 г.
  • Устный тур 22 марта 2012 г., решения

• Тридцать второй Турнир Городов, 2010-2011
  • Осенний тур
    • базовый вариант, 10 октября 2010 г.
    • сложный вариант, 24 октября 2010 г.
  • Весенний тур
    • базовый вариант, 27 февраля 2011 г.
    • сложный вариант, 13 марта 2011 г.
  • Устный тур 17 марта 2011 г., решения

Архив Турниров Городов

---

Подготовительные задачи к весеннему тренировочному туру XXVII Турнира Городов для младших классов

Политика оргкомитета Турнира заключается в том, чтобы предоставить возможность принять участие в олимпиаде как можно большему количеству школьников.

Иммунореактивность TASK-1, TASK-2, TASK-3 и TRAAK в каротидном теле крысы

. 20 сентября 2002 г.; 950 (1-2): 304-7.

doi: 10.1016/s0006-8993(02)03181-5.

Ёсио Ямамото ¹ , Вольфганг Куммер, Ясуро Атодзи, Ёситака Судзуки

принадлежность

• ¹ Лаборатория ветеринарной анатомии, факультет сельского хозяйства, Университет Гифу, 501-1193, Гифу, Япония. [email protected]

• PMID: 12231257
• DOI: 10.1016/s0006-8993(02)03181-5

Йошио Ямамото и др. Мозг Res. 2002 .

. 20 сентября 2002 г.; 950 (1-2): 304-7.

doi: 10.1016/s0006-8993(02)03181-5.

Авторы

Ёсио Ямамото ¹ , Вольфганг Куммер, Ясуро Атодзи, Ёситака Судзуки

принадлежность

• ¹ Лаборатория ветеринарной анатомии сельскохозяйственного факультета Университета Гифу, 501-1193, Гифу, Япония. [email protected]

• PMID: 12231257
• DOI: 10.1016/s0006-8993(02)03181-5

Абстрактный

В настоящей работе мы исследовали иммуногистохимическую локализацию двухпоровых К(+)-каналов TASK-1, TASK-2, TASK-3 и TRAAK в каротидном теле крысы. Клетки типа I были положительными для TASK-1, TASK-2, TASK-3 и TRAAK. Тела внутренних нервных клеток также были сильно положительными для TASK-1, TASK-2 и TRAAK, но отрицательными для TASK-3. Кроме того, некоторые клетки типа II, шванновские клетки в нервных пучках и фибробласты между кластерами клеток типа I также были иммуноокрашены для TASK-1. Гладкомышечные клетки каротидной артерии тела были интенсивно положительными для TASK-3. Наши результаты показывают, что иммунореактивность TASK-1 была повсеместно распространена во многих типах клеток, а иммунореактивность для TASK-2, TASK-3 и TRAAK представляла собой специфические типы распределения клеток в каротидном теле крысы.

Похожие статьи

• Гетерогенная экспрессия TASK-3 и TRAAK в параганглионарных клетках крысы.

  Ямамото Ю., Танигучи К. Ямамото Ю. и др. Гистохим клеточной биологии. 2003 г., октябрь; 120 (4): 335-9. doi: 10.1007/s00418-003-0577-5. Epub 2003, 26 сентября. Гистохим клеточной биологии. 2003. PMID: 14574589

• Экспрессия тандемного P-домена K+ канала, TREK-1, в каротидном теле крысы.

  Ямамото Ю., Танигучи К. Ямамото Ю. и др. J Гистохим Цитохим. 2006 г., апрель; 54 (4): 467-72. doi: 10.1369/jhc.5A6755.2005. Epub 2005, 12 декабря. J Гистохим Цитохим. 2006. PMID: 16344329

• Клеточное распределение кандидатов кислородных сенсоров – оксидаз, цитохромов, К+-каналов – в каротидном теле.

  Куммер В., Ямамото Ю. Куммер В. и др. Микроск Рес Тех. 2002 1 ноября; 59(3): 234-42. doi: 10.1002/jemt.10197. Микроск Рес Тех. 2002. PMID: 12384967 Обзор.

• Иммуногистохимическая колокализация TREK-1, TREK-2 и TRAAK с каналами TRP в клетках тройничного ганглия.

  Ямамото Ю., Хатакеяма Т., Танигучи К. Ямамото Ю. и др. Нейроски Летт. 2009 24 апреля; 454 (2): 129-33. doi: 10.1016/j.neulet.2009.02.069. Epub 2009 5 марта. Нейроски Летт. 2009 г.. PMID: 19429069

• Молекулярно-функциональные свойства двухпоровых калиевых каналов.

  Лесаж Ф., Лаздунски М. Лесаж Ф. и др. Am J Physiol Renal Physiol. 2000 ноябрь; 279(5):F793-801. doi: 10.1152/ajprenal.2000.279.5.F793. Am J Physiol Renal Physiol. 2000. PMID: 11053038 Обзор.

Посмотреть все похожие статьи

Цитируется

• Хеморецепторы каротидного тела: физиология, патология и последствия для здоровья и болезней.

  Iturriaga R, Alcayaga J, Chapleau MW, Somers VK. Итурриага Р. и др. Physiol Rev. 1 июля 2021 г .; 101 (3): 1177–1235. doi: 10.1152/physrev.00039.2019. Epub 2021 11 февраля. Физиол Ред. 2021. PMID: 33570461 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Экспрессия p11 и гетеромерных каналов TASK в гломусных клетках каротидного тела крысы и клетках PC12, дифференцированных по фактору роста нервов.

  Мацуока Х., Покорски М., Харада К., Йошимура Р., Иноуэ М. Мацуока Х. и др. J Гистохим Цитохим. 2020 Октябрь; 68 (10): 679-690. дои: 10.1369/0022155420955246. Epub 2020 4 сентября. J Гистохим Цитохим. 2020. PMID: 32886017 Бесплатная статья ЧВК.

• Влияние стимулятора вентиляции легких доксапрама на каналы человека TASK-3 (KCNK9, K2P9.1) и каналы TASK-1 (KCNK3, K2P3.1).

  Cunningham KP, MacIntyre DE, Mathie A, Veale EL. Каннингем К.П. и др. Acta Physiol (Oxf). 2020 фев; 228(2):e13361. дои: 10.1111/афа.13361. Epub 2019 18 сентября. Acta Physiol (Oxf). 2020. PMID: 31423744 Бесплатная статья ЧВК.

• Клетки каротидного тела типа I при хронической устойчивой гипоксии: внимание к метаболизму и возбудимости мембран.

  Пулгар-Сепульведа Р., Варас Р., Итурриага Р., Дель Рио Р., Ортис ФК. Пульгар-Сепульведа Р. и соавт. Фронт Физиол. 2018 19 сентября; 9:1282. doi: 10.3389/fphys.2018.01282. Электронная коллекция 2018. Фронт Физиол. 2018. PMID: 30283346 Бесплатная статья ЧВК.

• Кислородные и митохондриальные ингибиторы модулируют как мономерные, так и гетеромерные каналы TASK-1 и TASK-3 в клетках каротидного тела типа 1 мыши.

  Тернер П. Дж., Баклер К.Дж. Тернер П.Дж. и др. Дж. Физиол. 2013 Декабрь 1; 591 (23): 5977-98. doi: 10.1113/jphysiol.2013.262022. Epub 2013 16 сентября. Дж. Физиол. 2013. PMID: 24042502 Бесплатная статья ЧВК.

Просмотреть все статьи “Цитируется по”

термины MeSH

вещества

Ген KCNK9: MedlinePlus Genetics

калий двухпоровый домен канала подсемейства член K 9

Чтобы использовать функции обмена на этой странице, включите JavaScript.

Нормальная функция

Ген KCNK9 предоставляет инструкции для создания белка TASK3, который функционирует как калиевый канал. Калиевые каналы транспортируют положительно заряженные атомы (ионы) калия в клетки и из них.

Каналы TASK3 расположены по всему телу. Их особенно много в нервных клетках (нейронах) головного мозга, особенно в области мозга, которая координирует движение (мозжечок). Поток ионов через калиевые каналы в нейронах участвует в активации (возбуждении) нейронов и отправке электрических сигналов в мозг. В отличие от некоторых калиевых каналов, которые открываются и закрываются в ответ на определенные триггеры, каналы TASK3 всегда открыты, хотя их активность может контролироваться окружающей клеткой средой. Поскольку каналы всегда открыты, их часто называют фоновыми каналами или каналами утечки. Каналы TASK3 поддерживают способность клетки генерировать электрические сигналы и регулируют активность (возбудимость) клеток. Эти каналы, по-видимому, также играют роль в движении (миграции) определенных нейронов в головном мозге.

Люди наследуют две копии своих генов, одну от матери и одну от отца. Обычно обе копии каждого гена активны или «включены» в клетках. Однако для некоторых генов обычно включена только одна из двух копий. Какая копия активна, зависит от родителя происхождения: некоторые гены обычно активны только тогда, когда они унаследованы от отца человека; другие активны только тогда, когда унаследованы от матери человека. Это явление известно как геномный импринтинг. 9Ген 0147 KCNK9 является импринтированным геном, экспрессируемым по материнской линии, что означает, что активна только копия гена, исходящего от матери. Копия гена, полученная от отца, выключена (молчание).

Заболевания, связанные с генетическими изменениями

Синдром импринтинга KCNK9

Было обнаружено, что по крайней мере два изменения в гене KCNK9 , оба из которых имеют одинаковый эффект на канальный белок TASK3, вызывают синдром импринтинга KCNK9 . Это состояние характеризуется слабым мышечным тонусом (гипотонией) с рождения, что может повлиять на способность принимать пищу. Пострадавшие люди обычно имеют умственную отсталость и задержку развития речи и двигательных навыков, таких как ходьба. Потому что копия KCNK9 ген от отца молчат, состояние возникает только при наличии мутации в копии гена, унаследованного от матери.

Генные мутации, вызывающие синдром импринтинга KCNK9 , изменяют один строительный блок белка (аминокислоту) в канале TASK3; аминокислота аргинин заменяет аминокислоту глицин в положении 236 (обозначается как Gly236Arg или G236R). Это изменение снижает поток ионов через каналы TASK3 на 80 процентов. Исследования показывают, что некоторые нейроны с измененными каналами TASK3 не могут многократно генерировать электрические сигналы. Снижение транспорта ионов через каналы TASK3 нарушает нормальное развитие и возбудимость нейронов. Нарушение функции нейронов, вероятно, лежит в основе гипотонии, умственной отсталости и проблем развития, характерных для KCNK9 синдром импринтинга.

Подробнее об этом заболевании

Другие названия этого гена

• кислоточувствительный белок калиевого канала TASK-3
• K2p9.1
• KT3.2
• подсемейство калиевых каналов, член 9
• калиевый канал, двухпоровый домен, подсемейство K, член 8
• TASK-3
• TASK3
• TWIK кислоточувствительный K(+) канал 3
• двухпорный K(+) канал KT3.2
• двухпоровый калиевый канал KT3.2

Дополнительная информация и ресурсы

Тесты, внесенные в Реестр генетических тестов

• Тесты KCNK9

Научные статьи в PubMed

• PubMed

Каталог генов и болезней от OMIM

• КАЛИЙНЫЙ КАНАЛ, ПОДСЕМЕЙСТВО K, ЧЛЕН 9

Базы данных генов и вариантов

• Ген NCBI
• КлинВар

Ссылки

• Bando Y, Hirano T, Tagawa Y. Нарушение функции калиевых каналов KCNK Миграция нейронов в развивающейся коре головного мозга мыши. Кора головного мозга. 2014 Апр; 24(4):1017-29. doi: 10.1093/cercor/bhs387. Epub 2012, 12 декабря. Цитирование на PubMed
• Барел О., Шалев С.А., Офир Р., Коэн А., Злотогора Дж., Шорер З., Мазор Г., Файнер Г., Хатиб С., Зильберберг Н., Бирк О.С. Унаследованная по материнской линии Бирк Барел психическая синдром ретардации-дисморфизма, вызванный мутацией в геномном импринтированный калиевый канал KCNK9. Am J Hum Genet. 2008 г., август; 83 (2): 193-9. дои: 10.1016/j.ajhg.2008.07.010. Цитирование в PubMed или бесплатная статья в PubMed Central
• Enyedi P, Czirják G. Молекулярный фон токов K+ утечки: двухпорный домен калиевые каналы. Physiol Rev. 2010 Apr;90(2):559-605. дои: 10.1152/физрев.00029.2009. Обзор. Цитата в PubMed
• Грэм Дж. М. мл., Заде Н., Келли М., Тан Э. С., Лью В., Тан В., Дирдорф М. А., Уилсон Г. Н., Саги-Дайн Л., Шалев С.А. Синдром импринтинга KCNK9 – дальнейшее определение возможно излечимое расстройство. Am J Med Genet A. 2016 Oct;170(10):2632-7. дои: 10.1002/ajmg.a.37740. Epub 2016 6 мая. Цитирование на PubMed
• Молекулярная биология клетки (четвертое издание, 2002 г.): мембранный потенциал в клетках животных в основном зависит от каналов утечки K+ и градиента K+ через плазматическую мембрану
• Виле Э.Л., Хассан М., Уолш Ю., Аль-Мубарак Э., Мэти А. Восстановление тока через мутированные калиевые каналы TASK3, лежащие в основе синдрома Бирка-Бареля. Мол Фармакол. 2014 март; 85(3):397-407. doi: 10.1124/мол.113.090530. Epub 2013 16 декабря. Цитата в PubMed

Стресс-киназная регуляция TASK-1 и TASK-3 – FullText – Cellular Physiology and Biochemistry 2017, Vol. 44, No. 3

Предпосылки/Цели: Каналы TASK принадлежат к семейству двухпоровых калиевых (K _2P ) каналов. Обсуждается, что TASK-1 способствует развитию хронической фибрилляции предсердий (AFib) и вместе с разобщающим белком 1 был обнаружен в качестве белка-маркера жира бурой жировой ткани (BAT). Кроме того, TASK-1 был связан в исследовании ассоциации всего генома с повышенным индексом массы тела. Недавнее исследование показало, что ингибирование TASK-1 вызывает ожирение у мышей из-за отбеливания BAT и что эти эффекты связаны с путем рецептора минералокортикоидов, хотя механизм оставался неясным. Поэтому мы стремились выяснить, является ли K 9Каналы 0251 2P регулируются сывороточными и глюкокортикоид-индуцируемыми киназами (SGK), которые, как известно, модифицируют многие клеточные функции, модулируя ионные каналы. Методы: С этой целью мы использовали исследования функциональной коэкспрессии и хемилюминесцентные анализы в ооцитах Xenopus вместе с визуализацией флуоресценции и экспериментами количественной ПЦР. Результаты: SGK и протеинкиназа B (PKB) индуцировали сильное, зависящее от дозы и времени снижение тока TASK-1 и TASK-3. Коэкспрессия SGK снижала поверхностную экспрессию TASK-1/3, что приводило к преимущественной локализации каналов в поздних эндосомах. Понижающая регуляция каналов TASK-3 была аннулирована ингибитором динамина dynasore, что подтверждает роль SGK в эндоцитозе каналов TASK-1/3. Заключение: Опосредованные стрессом изменения в характере экспрессии или активации SGK, вероятно, изменяют экспрессию TASK-1/3 на поверхностной мембране. Наблюдаемая регуляция TASK-1 может способствовать патогенезу хронической ФП и обеспечивать механистическую связь между повышенными уровнями минералокортикоидов и снижением TASK-1, оба из которых связаны с отбеливанием BAT.

Введение

Семейство каналов K _2P млекопитающих состоит из 15 членов фоновых или протекающих калиевых каналов, играющих решающую роль в установлении мембранного потенциала покоя и, таким образом, в регуляции клеточной возбудимости во многих различных типах клеток и тканях. Кислоточувствительный K 9, связанный с TWIKКаналы 0007 + (TASK), принадлежащие к семейству калиевых каналов K _2P , имеют значение для патогенеза многих различных сердечно-сосудистых заболеваний [1, 2], включая легочную гипертензию [3], обструктивное апноэ сна [4] и аритмии типа мерцательная аритмия (AFib) [4-6] или нарушения проводимости [7, 8].

Например, каналы TASK-1 являются многообещающими лекарственными мишенями для лечения ФП, поскольку они активируются при ФП [9, 10] и поскольку эти каналы обладают способностью модулировать продолжительность предсердного потенциала действия человека в нормальных и патологических условиях [ 5, 10]. Поскольку у людей TASK-1 не имеет желудочковой экспрессии [5], фармакологическое ингибирование этого канала может продлить предсердную рефрактерность и преобразовать ФП, не вызывая опасных для жизни желудочковых побочных эффектов [4, 5]. С другой стороны, клиническая польза ингибирования TASK-1 при ФП, в частности предполагаемый побочный эффект легочной гипертензии, в настоящее время обсуждается [10-12]. Примечательно, что токи TASK-1 увеличились у пациентов с хронической ФП намного сильнее, чем ожидалось, исходя из транскрипционных изменений [10], что указывает на измененную регуляцию канала TASK-1 во время ФП.

Сообщалось, что TASK-1 играет роль в глюкозозависимой секреции инсулина бета-клетками [13]. Однако TASK-1 может иметь отношение не только к диабету, но и к ожирению, двум клиническим состояниям, которые часто идут рука об руку. Считается, что бурая жировая ткань (БЖТ) защищает от ожирения, поскольку ее активация вызывает состояние повышенного расхода энергии. Однако происхождение и молекулярная идентичность BAT долгое время оставались неясными. Метод секвенирования РНК и беспристрастного полногеномного анализа экспрессии недавно идентифицировал TASK-1 (9).0147 KCNK3 ) в качестве маркера БЖТ [14]. Это исследование подтвердило предыдущее сообщение о том, что митохондриальный разобщающий белок ( UCP1 ) вместе с KCNK3 являются генетическими маркерами BAT, поскольку у людей они по-разному экспрессируются в BAT по сравнению с белой жировой тканью (WAT) [15]. Обратите внимание, что TASK1-подобные одиночные каналы были ранее описаны в BAT крыс [16], но также другой канал K _2P , KCNK10 , может иметь значение в контексте ожирения, так как этот канал играет роль на ранних стадиях адипоцитарного роста. дифференциация [17]. В соответствии с идентификацией TASK-1 как маркера BAT, недавнее полногеномное исследование ассоциации (GWAS) выявило связь KCNK3 с повышенным индексом массы тела [18]. Кроме того, экспрессия TASK-1 и UCP1 коррелировала у тучных мышей и мышей, подвергшихся воздействию холода [19], и, что наиболее поразительно, мыши с нокаутом TASK-1 имеют избыточный вес из-за увеличения массы WAT и побеления BAT [19]. Был сделан вывод, что TASK-1 контролирует термогенную активность в BAT, так как снижение потребления кислорода, экспрессии UCP1 и липолиза было очевидным при стимуляции рецептора β ₃ . Блокатор TASK-1 A293 или активация минералокортикоидного пути имитировали эти эффекты, предполагая связь между TASK-1 и путем активации минералокортикоидного рецептора. Эта связь между TASK-1 и минералокортикоидными рецепторами подтверждается тем фактом, что добавление альдостерона к адипоцитам мышей с нокаутом TASK-1 не вызывало дополнительных или усиленных эффектов [19]. ]. Тем не менее, оставалось неясным, как путь минералокортикоидов механистически связан с каналами TASK-1. Интересно, что киназа-1, индуцируемая сывороткой и глюкокортикоидами (SGK1), сверхэкспрессируется в жировой ткани у людей с ожирением и диабетом [20]. Поскольку киназы SGK являются известными регуляторами ионных каналов, мы начали проверять, регулируются ли этими киназами каналы K _2P , в частности TASK-1; с целью установить связь между наблюдаемыми изменениями экспрессии SGK и ролью минералокортикоидов в отбеливании бурого жира.

SGK1 первоначально был идентифицирован в опухолевых клетках молочной железы крыс, где он был описан как ранний ген с транскрипцией, стимулированной сывороткой и глюкокортикоидами [21-23]. SGK принадлежат к семейству киназ AGC, и все три члена семейства SGK имеют высокую аминокислотную гомологию с протеинкиназой B (PKB), также известной как Akt. Активность SGK находится под контролем транскрипции с помощью многочисленных стимулов, включая альдостерон [24] или состояние фосфорилирования. Каноническим механизмом активации всех трех изоформ SGK является фосфатидилинозитид-3-киназа (PI ₃ К) путь [25]. Активация пути индуцирует продукцию фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата (PIP ₃ ) с помощью PI ₃ K. Эти липиды служат сайтами стыковки плазматической мембраны для белков, несущих домены гомологии с плекстрином, включая фосфоинозитид-зависимую киназу 1 (PDK1), что приводит к фосфорилированию SGK. Кроме того, PIP ₃ приводит к активации mTORC2 и фосфорилированию SGK [26]. SGK модифицируют множество клеточных функций либо путем прямого фосфорилирования ионных каналов и транспортеров, либо путем фосфорилирования их регулирующих белков, либо путем транскрипционных изменений [24, 27-34]. Поразительно, но SGK преимущественно усиливают активность ионных каналов и транспортеров за счет увеличения экспрессии белков на плазматической мембране [24].

С помощью функционального скрининга коэкспрессии мы обнаружили предпочтительное и необычное подавление каналов TASK-1 и TASK-3. Все три SGK, а также близкородственные PKB или PDK, которые активируют SGK, снижают амплитуды тока TASK-1 и TASK-3 за счет интернализации каналов в поздние эндосомы. Таким образом, опосредованные стрессом изменения уровней экспрессии SGK или измененная активация SGK, вероятно, изменяют экспрессию TASK-1 и TASK-3 на плазматической мембране. Это необычное подавление TASK-1 с помощью SGK, вероятно, способствует патогенезу хронической ФП и может обеспечить механистическую связь между повышенными уровнями минералокортикоидов и снижением TASK-1, эффекты, которые, как недавно было установлено, связаны и ответственны за коричневую ткань. жирное отбеливание.

Материалы и методы

Этическое одобрение

Исследование соответствует руководству по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Publ. 85-23). Образцы тканей человека были получены из придатков правого предсердия (ПП). Протокол исследования одобрен комитетами по этике Гейдельбергского университета (Германия; медицинский факультет Гейдельберга, S-017/2013). От всех пациентов было получено письменное информированное согласие, исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Молекулярная биология

Канальные конструкции человека K _2P (TASK-1, TASK-3, TASK-4, TRESK и TRAAK) и AS160 были клонированы в вектор экспрессии ооцитов pSGEM. Конструкции SGK-1, SGK-1 SD, SGK-2, SGK-3, SGK-3 SD, PKB и PDK использовали, как описано ранее. Для хемилюминесцентного анализа гемагглютининовый (HA)-эпитоп (YPYDVPDYA), которому предшествовал и за которым следовал пралин-глицин-глициновый линкер, был вставлен во внеклеточную петлю P2-M4 крысиного TASK-1 в положении аминокислоты 214, как описано ранее. [35]. TASK-3 был клонирован в вектор pEGFP-C1 для экспериментов по визуализации.

Получение ооцитов, синтез кРНК и инъекция кРНК

Ооциты получали от наркотизированных лягушек Xenopus laevis и инкубировали в растворе OR2, содержащем в мМ: NaCl 82,5, KCl 2, MgCl ₂ 1, HEPES 5) замещенный с 2 мг/мл коллагеназы II (Sigma) для удаления остаточной соединительной ткани. Затем ооциты хранили при 18 °C в растворе ND96 с добавлением 50 мг/л гентамицина, 274 мг/л пирувата натрия и 88 мг/л теофиллина. Все каналы и киназы субклонировали в вектор экспрессии ооцитов, а кДНК линеаризовали. кРНК синтезировали с помощью mMESSAGE mMACHINE-Kit (Ambion). Качество кРНК проверяли с помощью гель-электрофореза. В каждый ооцит вводили по 50 нл кРНК.

Экспрессия каналов TASK в ооцитах

В ооциты стадии IV и V вводили кРНК. Для экспериментов по совместной экспрессии использовали 25 нг кРНК киназ (SGK1, SGK2, SGK3, PKB, PDK или AS160). На рис. 3 50 мкг TASK-3 вводили совместно с 50 мкг (1:1), 500 мкг (1:10), 5 нг (1:100) или 25 нг (1:500) кРНК SGK-2. . Запись стандартного двухмикроэлектродного зажима напряжения (TEVC) выполняли при комнатной температуре (20-22°C) через 1-3 дня после инъекции кРНК с помощью усилителя TurboTEC 10CD (npi) и Digidata серии 1200 (Axon Instruments) как A/ преобразователь Д. Микропипетки изготавливали из боросиликатных стеклянных капилляров GB 150TF-8P (Science Products) и вытягивали с помощью DMZ-Universal Puller (Zeitz). Регистрирующие пипетки имели сопротивление 0,5-1,5 МОм и заполнялись 3 М раствором KCl. НД96 использовали в качестве регистрирующего раствора, содержащего в мМ: NaCl 96, KCl 2, CaCl ₂ 1,8, MgCl ₂ 1, HEPES 5 (pH 7,5).

Рис. 3.

SGK2 вызывает зависящее от времени и дозы снижение амплитуд тока TASK-3. кРНК TASK-3 (50 пг) вводили в ооцитов Xenopus и одновременно вводили указанные количества кРНК SGK2 (50 пг (1:1), 500 пг (1:10), 5 нг (1:100) или 25 нг (1:500)). Измеряли токи при +40 мВ (А) через 24 ч, (Б) через 48 ч или (В) через 72 ч после инъекции. Под каждым кружком указаны номера экспериментов.

Хемилюминесцентный анализ

S Поверхностная экспрессия конструкции канала TASK-1, меченной HA, была проанализирована в ооцитах Xenopus . Через два дня после введения кРНК ооциты инкубировали в течение 30 мин в растворе ND96, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), при 4°С для блокирования неспецифического связывания антител. Затем ооциты инкубировали в течение 60 мин при 4°C с 1 мкг/мкл крысиного моноклонального антитела против HA (клон 3F10, Roche) в 1% BSA/ND96, шесть раз промывали при 4°C 1% BSA/ND9.6, и инкубировали с 2 мкг/мкл конъюгированного с пероксидазой аффинно очищенного фрагмента F(ab)2 козьего антикрысиного IgG-антитела (Dianova) в 1% BSA/ND96 в течение 60 мин. Ооциты тщательно промывали сначала в 1% БСА/ND96 (при 4°С в течение 60 мин), а затем в ND96 без БСА (при 4°С в течение 15 мин). Отдельные ооциты помещали в 20 мкл раствора SuperSignal Elisa Femto (Pierce) и количественно определяли хемилюминесценцию в люминометре (Promega). Люминесценцию неинъецированных ооцитов использовали в качестве эталонного сигнала (отрицательный контроль).

Флуоресцентная микроскопия

Клетки HeLa и COS-7 выращивали примерно до 50 % слияния на покровных стеклах в чашках Петри диаметром 35 мм (Nunc) с использованием среды DMEM, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (Gibco/Thermo Fisher Scientific) + 1 % пенициллин/стрептомицин (Gibco/Thermo Fisher Scientific). Для визуализации живых клеток клетки выращивали в чашках Петри со стеклянным дном диаметром 35 мм (Willco). Через 24 часа клетки трансфицировали с использованием набора jetprime (Polyplus transfection) (Peqlab) в соответствии с инструкциями производителя с использованием 0,2 мкг pEGFP-C1 TASK3 или 1 мкг pcDNA3.1 SGK1 вместе с 0,2 мкг pEGFP-C1 TASK3. Клетки культивировали при 37 °C в течение 6–36 ч в инкубаторе с 5 % CO 9 .0251 2 /95 % О ₂ . Иммунофлуоресценцию и визуализацию живых клеток выполняли с использованием платформы визуализации Zeiss, включающей микроскоп Axio Observer.Z1, оснащенный объективом Plan-Apochromat 60×/1,40 Oil DIC и стандартным набором фильтров для EGFP и DSRed (Zeiss 38HE). Цифровые изображения были получены с помощью 12-битной камеры «AxioCam MRm» и обработаны с помощью программного обеспечения AxioVision. Для экспериментов по иммунофлуоресценции клетки фиксировали 4% PFA + 4% сахарозы, пермеабилизировали 0,25% (об./об.) Triton X-100 в PBS и окрашивали антителами против поздних эндосом (CD63 1:200, Santa Cruz Biotechnology) и вторичных Антитела Alexa 568 (1:200, Molecular Probes). Ингибирование эндоцитоза в клетках Hela осуществляли путем инкубации с ингибитором динамина dynasore (80 мкМ, Sigma), нанесенным не менее чем через 4 часа после трансфекции.

Количественная ПЦР в реальном времени

Количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-кПЦР) проводилась с использованием StepOnePlus (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Тотальную РНК готовили с использованием TRIzol-Reagent (Invitrogen, Карлсруэ, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Комплементарный синтез ДНК осуществляли с помощью набора для синтеза кДНК Maxima First Strand для RT-qPCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с использованием 3 мкг тотальной РНК. Затем наносили 96-луночные планшеты для оптического обнаружения (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) до общего объема 10 мкл на лунку, состоящего из 0,5 мкл кДНК, 5 мкл TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems) и 6- зонды и праймеры TaqMan, меченные карбоксифлуоресцеином (FAM) (TaqMan Gene Expression Assays; Applied Biosystems). Кроме того, для нормализации использовали заранее разработанные праймеры и зонды, определяющие импортин 8 (IPO8). Все реакции RT-qPCR проводили в трех экземплярах, включая контрольные эксперименты в отсутствие кДНК. Данные выражены как среднее из трех повторов. Использовали праймеры со следующими номерами доступа: IPO8 (Importin 8), Hs00183533_m1; СГК1, Hs00178612_ m1; СГК2, Hs00367639_м1; СГК3, Hs00993639_m1.

Анализ данных

R Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = количество ооцитов). Статистические различия оценивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента. Значимость принималась для p <0,05, обозначенных на рисунках звездочкой (*), p <0,01, двумя звездочками (**), p<0,001 тремя звездочками (***) или «н.с. ” на несущественные изменения.

Результаты

СГК, ПКБ и ПДК снижают токи ЗАДАЧ-1 и ЗАДАЧ-3

Чтобы исследовать регуляцию каналов K _2P с помощью SGK, мы провели эксперименты по совместной экспрессии в ооцитах Xenopus laevis (рис. 1). При этом коэкспрессия SGK2 не влияла на амплитуды токов TASK-4, TRESK и TRAAK, но вызывала выраженное снижение токов, кодируемых кислоточувствительными каналами K _2P TASK-1 и TASK-3 (рис. 1А). , Б). Чтобы проверить предполагаемое ингибирование токов TASK-1 и TASK-3 другими изоформами SGK и PKB, имеющими высокую гомологию с SGK2, эти киназы были индивидуально коэкспрессированы с TASK-1 и TASK-3 в Xenopus ооцитов. Все киназы обладали способностью сильно снижать амплитуды тока как TASK-1 (рис. 2A), так и TASK-3 (рис. 2B), хотя и с разной эффективностью. Для обоих каналов TASK SGK2 вызвал наиболее выраженное снижение тока из всех протестированных изоформ SGK. Известно, что PDK фосфорилируют и тем самым активируют SGK. PDK вводили совместно с TASK-1 или TASK-3 (рис. 2A, B). PDK вызывает снижение тока в обоих каналах, скорее всего, косвенно через активацию эндогенных SGK, поскольку TASK-1/3 не содержат консенсусных сайтов фосфорилирования PDK. Кроме того, мы коэкспрессировали TASK-1 или TASK-3 с доминирующими активными конструкциями SGK, SGK1 ^S422D (SGK1 SD) и SGK3 ^S356D (SGK3 SD), имитируя фосфорилирование SGK на его С-конце, тем самым активируя киназы. Совместная экспрессия обоих, SGK1 SD и SGK3 SD, привела к еще более выраженному снижению TASK-1 (рис. 2C), а также TASK-3 (рис. 2D).

Рис. 1.

СГК2 уменьшает амплитуды тока каналов ЗАДАЧ-1 и ЗАДАЧ-3. (A), репрезентативные измерения соотношения тока и напряжения в ооцитах Xenopus , которым вводили кРНК TASK-1 (1,5 нг/ооцит), TASK-3 (50 пг/ооцит) или TRAAK (2,5 нг/ооцит) (верхняя панель) или совместно инъецировали кРНК SGK2 (25 нг/ооцит) (нижняя панель). Напряжение меняли от удерживающего потенциала -80 мВ до потенциалов в диапазоне от -100 мВ до +60 мВ с шагом 20 мВ. Длительность скачка напряжения составляла 200 мс, и скачки напряжения повторялись каждые 2 с. За тестовыми импульсами следовал шаг до -40 мВ. (B), нормализованные амплитуды тока при +40 мВ различных K _2P канала, вводимые отдельно или совместно с SGK2. Xenopus ооцитов инъецировали TASK-4 (25 нг/ооцит), TRESK (2,5 нг/ооцит) или совместно инъецировали с кРНК SGK2 (25 нг/ооцит) и регистрировали через 48 часов после инъекции. Количество экспериментов указано на гистограмме.

Рис. 2.

СГК, ПКБ и ПДК уменьшают амплитуды тока ЗАДАЧ-1 и ЗАДАЧ-3. (A) Влияние SGK1, SGK2, SGK3, PKB и PDK (25 нг/ооцит) на среднюю амплитуду тока TASK-1 (1,5 нг/ооцит) или (B), TASK-3 (50 нг/ооцит) ) при +40 мВ, зафиксировано в Ооциты Xenopus через 48 ч после инъекции кРНК. (C) Доминантный активный мутант SGK1 (SGK1 SD) или SGK3 (SGK3 SD) был инъецирован совместно с TASK-1 или (D), TASK-3 в ооцитов Xenopus , и средние амплитуды тока при +40 мВ анализировали через 48 ч после инъекции кРНК. Количество экспериментов указано на гистограмме.

Влияние SGK-2 на TASK-3 зависит от времени и дозы

Киназы SGK почти исключительно увеличивают поверхностную экспрессию многих ионных каналов и транспортеров, хотя и по другому механизму. Удивительно, но в этом исследовании мы заметили снижение тока K _2P каналы TASK-1 и TASK-3 через киназы SGK, PKB и PDK. Поэтому мы изучили потенциальную дозовую и временную зависимость эффекта. Для этого в ооцитах коэкспрессировали различные соотношения кРНК (1:1, 1:10, 1:100 и 1:500) TASK-3 и SGK2 и измеряли амплитуды тока в разные моменты времени после инъекции (24 ч, 48 ч и 72 ч) (рис. 3). Здесь небольшое количество SGK2 (соотношение канала к киназы от 1:1 до 1:10) приводило к увеличению тока через 24 и 48 часов, тогда как присутствие большего количества SGK2, аналогично тому, что использовалось при начальном поиске модулированного K _2P канала или записи в более поздние моменты времени (72 ч) привели к снижению тока. Через 72 часа все испытанные отношения привели к снижению тока TASK-3. В заключение, понижающая регуляция TASK-3, по-видимому, зависит от концентрации и времени.

SGK уменьшает поверхностную экспрессию каналов TASK-1/3

Чтобы определить основной механизм, приводящий к изменениям амплитуд каналов, мы количественно оценили поверхностную экспрессию TASK-1 после коэкспрессии SGK2. Для этой цели внеклеточный эпитоп HA вводили во вторую петлю внеклеточной поры TASK-1. При выполнении хемилюминесцентного анализа на основе ELISA коэкспрессия SGK-2 (1: 500) вызывала снижение поверхностной экспрессии TASK-1 (рис. 4A). Кроме того, мы выполнили визуализацию живых клеток в клетках COS-7, трансфицированных TASK-3 pEGFP отдельно или вместе с SGK-1. Через 24 ч в присутствии SGK-1 TASK-3 почти не определялся на плазматической мембране, и наблюдался точечный, предположительно эндосомальный рисунок (рис. 4B). Таким образом, SGK могут регулировать транспортировку TASK-3, что приводит к увеличению доли внутриклеточного белка канала.

Рис. 4.

SGK2 уменьшает поверхностную экспрессию TASK-1. (A) Люминометрическая количественная оценка поверхностной экспрессии внеклеточно меченных HA каналов TASK-1 (TASK-1 ^HA ) в ооцитах Xenopus . Относительную поверхностную экспрессию (± SEM) после совместной инъекции SGK2 нормализовали до TASK-1 ^HA . n.i.: неинъецированные ооциты. Количество экспериментов указано на гистограмме. (B), визуализация живых клеток в клетках COS-7 через 24 часа после трансфекции TASK-3 pEGFP отдельно (верхняя панель) или вместе с SGK1.

TASK-3 совместно локализуется с маркером поздней эндосомы CD63

Чтобы получить дополнительные сведения о внутриклеточной локализации TASK-3 в присутствии SGK1, мы трансфицировали клетки HeLa с помощью TASK-3 pEGFP отдельно или вместе с SGK1. Клетки фиксировали через 24 ч после трансфекции и окрашивали поздним эндосомальным маркером CD63 (рис. 5). Эти эксперименты показали, что коэкспрессия SGK1 приводит к более выраженной эндосомальной локализации TASK-3, на что указывает совместная локализация с CD63 (рис. 5F). Кроме того, временные эксперименты в клетках HeLa показали, что через 12 часов после трансфекции TASK-3 уже достигает поверхностной мембраны, в то время как TASK-3, коэкспрессируемый с SGK1, по-прежнему преимущественно локализуется в цитоплазматических везикулах (все материалы онлайн-приложений см. на сайте www. karger.com/doi/10.1159/000485402, Доп. Рис. 1Б, Е). Через 24 часа инкубации TASK-3 сильно экспрессируется на плазматической мембране, в то время как TASK-3, совместно экспрессирующийся с SGK1, демонстрирует явно сниженную поверхностную экспрессию и множество везикул вокруг ядер (см. материал онлайн-приложения, рис. 1C, G приложения). ). Через 36 часов TASK-3 по-прежнему локализовался преимущественно на плазматической мембране, в то время как коэкспрессия с SGK1, по-видимому, восстанавливала каналы к везикулам в околоядерной области (см. материал онлайн-приложения, рис. 1D, H в дополнении).

Рис. 5.

Сверхэкспрессия SGK1 приводит к локализации TASK-3 в позднем эндосомоподобном компартменте. Клетки HeLa трансфицировали (AC), TASK-3 pEGFP или (D-F), TASK-3 pEGFP и SGK1. Через 24 ч после трансфекции клетки фиксировали и окрашивали поздним эндосомальным маркером CD63 (пурпурный). (C), слияние изображений (A) и (B). (F), слияние изображений (D) и (E).

TASK-3 в присутствии SGK2 интернализуется через Rab4- и Rab5-зависимый путь

Мы наблюдали, что коэкспрессия TASK-1 и TASK-3 с SGK приводит к быстрому снижению тока, особенно при использовании более высокие концентрации SGK (рис. 3A). Таким образом, мы предположили, что каналы, чтобы достичь позднего эндосомального компартмента, быстро интернализуются ранним эндосомальным путем. Чтобы решить этот вопрос, TASK-3 вместе с SGK2 коэкспрессировали либо с Rab дикого типа, либо с его доминантно-негативной конструкцией (рис. 6A, B). Ингибирование раннего эндоцитоза с помощью доминантно-негативного Rab4 или доминантно-негативного Rab5 увеличивает амплитуды тока TASK-3 (рис. 6A, B). Эти данные указывают на то, что TASK-3 находится в присутствии SGK2, эндоцитированного через Rab4- и Rab5-зависимый путь раннего эндоцитоза.

Рис. 6.

Эндоцитоз TASK-3 с помощью SGK2 опосредуется Rab4- и Rab5-зависимым путем. TASK-3 вместе с SGK2 коэкспрессировался либо с конструкциями Rab дикого типа, либо с доминантно-отрицательными конструкциями в ооцитах Xenopus , и амплитуды тока анализировали через 48 часов после инъекции. (A), репрезентативные текущие следы TASK-3 вместе с SGK2 в присутствии Rab-белков дикого типа или доминантно-негативных. (B), соответствующий анализ изменений амплитуд тока. Количество экспериментов указано на гистограмме.

Опосредованное SGK снижение поверхностной экспрессии TASK-3 противодействует блокированию клатрин-опосредованного эндоцитоза

Dynasore блокирует динамин и является специфическим и высокоэффективным блокатором клатрин-опосредованного эндоцитоза. В этом исследовании мы применяли dynasore (80 мкМ) после трансфекции клеток HeLa с помощью TASK-3 отдельно или вместе с SGK1. Аналогично описанному выше (см. материалы онлайн-приложений, Доп. рис. 1C, G), через 24 часа после трансфекции TASK-3 вместе с SGK1 канал располагался на поверхности мембраны, хотя и со сниженной эффективностью (рис. 7A, B), что также становится очевидным по менее выраженному образованию филоподий (рис. 7B и см. материал онлайн-приложения, рис. 1G приложения). Поразительно, когда клетки котрансфицировали TASK-3 и SGK1 в присутствии dynasore, мы наблюдали массивное увеличение флуоресценции на плазматической мембране и выраженное образование филоподий, подтверждая, что текущее снижение TASK-3 с помощью SGK опосредуется путем эндоцитоза.

Рис. 7.

SGK1 приводит к клатрин-зависимому эндоцитозу TASK-3. Визуализация живых клеток HeLa через 24 ч после трансфекции (A), TASK-3 pEGFP, (B), TASK-3 pEGFP и SGK1, (C), TASK-3 pEGFP и SGK1 в присутствии 80 мкМ динамина -ингибитор диназор.

Предполагаемые партнеры по взаимодействию, опосредующие косвенное влияние СГК и ПКБ на ЗАДАЧУ-1/3?

Поскольку TASK-1 и TASK-3 не содержат консенсусных мотивов для фосфорилирования SGK или PKB, наблюдаемая регуляция канала TASK должна быть непрямой по своей природе. Описано несколько механизмов непрямой регуляции ионных каналов посредством SGK, включая участие Nedd4-2, NHERF2, PIKfyve, AS160 или 14-3-3. Поскольку поверхностная экспрессия TASK-1 и TASK-3 регулируется зависимым образом 14-3-3, мы проверили, может ли AS160 участвовать в наблюдаемых эффектах. AS160 был описан как Akt Субстрат с 160 килодальтон (AS160), так как он фосфорилирован PKB. Фосфорилирование AS160 с помощью PKB ( Akt ) или SGK приведет к связыванию 14-3-3, что может помешать эффективной поверхностной экспрессии TASK-1/3. Совместная инъекция AS160 с TASK-3 привела к такому же снижению тока, как и совместная инъекция небольших количеств SGK2 (см. материалы онлайн-приложений, рис. 2 приложения). Более того, коэкспрессия обоих, небольших количеств SGK2 и AS160, приводила к еще более выраженному снижению тока TASK-3. Однако известно, что 14-3-3 регулирует прямой трафик TASK-1 и TASK-3, а не канальный эндоцитоз. Таким образом, несмотря на некоторые доказательства участия AS160 в регуляции канала TASK, полный путь и медиаторы непрямой модуляции канала TASK с помощью SGK в настоящее время остаются неуловимыми (рис. 8).

Рис. 8.

Предполагаемые партнеры по взаимодействию, опосредующие косвенное влияние СГК и ПКБ на ЗАДАЧ-1/3. На рисунке показано, что PI ₃ -киназный путь должен регулировать каналы TASK-1/3 посредством активации PDK/SGK. Кроме того, показано, что этот непрямой путь может включать множество различных белков. RTK, рецепторная тирозинкиназа; NHERF, Na ⁺ /H ⁺ обменный регулирующий фактор; NEDD4-2, ген 4-2, экспрессируемый нервными клетками-предшественниками, подавленный в процессе развития; AS160, Akt Substrate на 160 килодальтон; PI3Kα, фосфоинозитид-3-киназа α.

Снижение экспрессии SGK1 и SGK2 в предсердных кардиомиоцитах пациентов с хронической ФП может способствовать увеличению токов TASK-1

TASK-1 является многообещающей мишенью для лечения и профилактики ФП. Ранее при хронической ФП наблюдалась активация TASK-1, что могло способствовать патогенезу этой распространенной аритмии. Неожиданно токи TASK-1, зарегистрированные в предсердных кардиомиоцитах пациентов с хронической ФП, были увеличены больше, чем ожидалось, за счет транскрипционных изменений в мРНК и результирующих уровней белка. Этот эффект отсутствовал у пациентов с пароксизмальной ФП. С помощью количественных ПЦР-экспериментов мы проанализировали изменения экспрессии мРНК SGK1-3 в предсердных кардиомиоцитах контрольных пробандов по сравнению с пациентами с пароксизмальной и хронической ФП (рис. 9).и см. онлайн-приложение. материал, доп. Рис. 3). В предсердных кардиомиоцитах пациентов с хронической ФП мы наблюдали снижение уровня экспрессии SGK1 и SGK2, отсутствующее у пациентов с пароксизмальной формой ФП. Сниженные уровни экспрессии SGK1 и SGK2 могут способствовать выраженному увеличению токов TASK-1, типичному для хронической ФП, поскольку сниженные уровни SGK, вероятно, увеличивают поверхностную экспрессию TASK-1 и TASK-3.

Рис. 9.

Снижение экспрессии SGK1 и SGK2 в кардиомиоцитах предсердий у пациентов с хронической ФП. Эксперименты с количественной ПЦР, анализирующие изменения экспрессии SGK у пациентов с хронической фибрилляцией предсердий (cAFib). Экспрессия мРНК (± SEM) нормирована на IPO8 для (A), SGK1 (B), SGK2 и (C), SGK3. Было проанализировано от двух до четырех троек, и общее количество экспериментов указано на гистограммах.

Обсуждение

Мы наблюдали, что SGK вызывают сильное снижение токов TASK-1 и TASK-3 за счет уменьшения количества каналов на плазматической мембране, как показано с помощью записей фиксации напряжения в сочетании с хемилюминесцентным анализом на основе ELISA. . Все изоформы SGK, а также PKB обладают общей способностью снижать амплитуды тока как TASK-1, так и TASK-3. Эксперименты с флуоресцентной визуализацией показали, что в присутствии SGK1 TASK-3 лишь слабо экспрессируется на плазматической мембране и что коэкспрессия SGK1 приводит к преимущественной локализации каналов TASK-3 в эндосомоподобном компартменте. Понижающая регуляция TASK-3 была устранена ингибитором динамина dynasore, что указывает на роль SGK в эндоцитозе канала TASK. TASK-1 и TASK-3 не имеют согласованной последовательности, предсказывающей сайт фосфорилирования SGK. Таким образом, вероятна непрямая модуляция SGK, и ранее было описано несколько механизмов такой непрямой регуляции [36-44]. Субстраты, опосредующие эффекты SGK, включают, например, PIKfyve, AS160, Nedd4-2, NHERF2 или 14-3-3 [45-47]. Интересно, что каналы TASK регулируются посредством 14-3-3, усиливая поверхностную экспрессию канала. Поскольку кроме ЗАДАЧ-1 и ЗАДАЧ-3 ни один из испытанных К _2P каналы чувствительны к SGK и 14-3-3 [35, 48, 49], возможно, что эффекты SGK опосредованы 14-3-3 и регулятором белка Rab AS160. В случае эпителиального натриевого канала ENaC, Liang et al . [47] показали, что альдостерон индуцирует фосфорилирование AS160 в его сайтах фосфорилирования SGK1, вызывает связывание AS160 со стероид-индуцированными 14-3-3 изоформами β и ε [47]. Это взаимодействие AS160 с 14-3-3β и ε было заблокировано мутациями в сайтах фосфорилирования SGK1, что подавляло способность AS160 усиливать действие альдостерона на ENaC [47]. В наших экспериментах коэкспрессия AS160 приводила к снижению токов TASK-3, что было еще более выражено в присутствии SGK2. Таким образом, фосфорилирование AS160 с помощью SGK может вызывать связывание 14-3-3 или удаление 14-3-3, что, однако, необходимо для прямого транспорта TASK. С другой стороны, наши эксперименты четко идентифицировали повышенный эндоцитоз каналов TASK и не указывают на измененный прямой транспорт. Таким образом, точный механизм непрямой регуляции каналов TASK и субстратов, опосредующих эти эффекты SGK, в настоящее время остается неясным и включает множество предполагаемых путей (рис.  8). Поскольку SGK почти исключительно увеличивают поверхностную экспрессию ионных каналов и транспортеров, эффект повышенного эндоцитоза каналов TASK-1 и TASK-3 может подчиняться необычному или еще не идентифицированному новому пути. Таким образом, определение точных механизмов и партнеров торговли людьми потребует независимых и интенсивных будущих исследований.

Во время AFib KCNK3 (TASK-1) транскрипционно активируется [9, 10], эффект, который мы также наблюдали в наших руках (не опубликовано). В исследовании Schmidt et al. , TASK-1 активируется в предсердных кардиомиоцитах у пациентов с хронической ФП в 1,6 раза на уровне мРНК и белка [10]. Однако токи TASK-1, регистрируемые с предсердных кардиомиоцитов этих больных, увеличивались значительно сильнее (в 3 раза), что приводило к укорочению потенциалов действия у больных с хронической ФП. Поскольку токи TASK-1 увеличились намного сильнее, чем ожидалось, за счет изменений на уровне мРНК и белка, это предполагало измененную регуляцию поверхностной экспрессии TASK-1 или гейтирование во время AFib. Снижение транскрипции SGK1 и SGK2 в предсердиях пациентов с хронической ФП, которое мы обнаружили в нашем текущем исследовании, может объяснить неожиданно выраженное увеличение амплитуд тока TASK-1 во время ФП (рис. 10A). Однако этот эффект может быть важным фактором, способствующим электрическому ремоделированию и хронизации ФП за счет увеличения токов TASK-1 и повышения скорости реполяризации.

Рис. 10.

Предполагаемая роль модуляции TASK-1 с помощью SGK в отбеливании AFib и BAT. (A), рисунок иллюстрирует, что увеличение тока TASK-1 при хронической ФП может происходить синергическим образом за счет повышения уровня транскрипции и увеличения количества каналов на поверхности мембраны из-за снижения уровней экспрессии SGK1 и SGK2. (B), рисунок иллюстрирует, что фармакологический и генетический блок TASK-1 приводит к отбеливанию бурого жира в тканях, что связано с активацией пути рецептора минералокортикоидов, хотя с еще неясным механизмом (?). Мы предполагаем, что механистическая связь между стимуляцией пути минералокортикоидных рецепторов и ингибированием TASK-1 при отбеливании бурой жировой ткани отражается зависимым от SGK ингибированием TASK-1.

Мыши, нокаутированные по TASK-1, имеют избыточный вес из-за увеличения массы WAT и побеления BAT [19]. Было обнаружено, что TASK-1 контролирует термогенную активность в BAT и что блокаторы TASK-1 или минералокортикоиды имитируют эти эффекты. Хотя связь между TASK-1 и минералокортикоидными рецепторами была тщательно разработана и подтверждена, т. е. тем фактом, что альдостерон не может индуцировать эффекты в адипоцитах мышей с нокаутом TASK-1 [19], механизм этой функциональной связи оставался неясным. Согласно нашим новым данным, повышенные уровни минералокортикоидов должны стимулировать SGK в адипоцитах, что приводит к снижению функциональных токов TASK-1 на плазматической мембране, подобно тому, как это происходит в генетической мышиной модели или с помощью A29.3, демонстрируя отсутствующую механистическую связь для отбеливания BAT, наблюдаемого за счет снижения экспрессии TASK-1 или повышения уровня минералокортикоидов (рис. 10B). Эта гипотеза дополнительно подтверждается тем фактом, что SGK1 сверхэкспрессируется в жировой ткани у людей с ожирением и диабетом [20].

У пациентов с диабетом 2 типа повышен уровень инсулина, что приводит к усилению PI ₃ -киназного пути, который, как считается, вызывает нарушения сердечной реполяризации и аритмии [50]. Активация PI ₃ -kinase-pathway также приведет к активации SGK и может вызвать сокращение каналов TASK. Следовательно, эти эффекты могут способствовать развитию сердечных аритмий и ожирения, наблюдаемых при диабете. Для диабета это будет отражать circulus vitiosus , поскольку ожирение участвует в развитии гиперинсулинизма.

Подводя итог, мы предполагаем, что вызванные стрессом изменения в характере экспрессии или активации SGK, вероятно, изменяют экспрессию TASK-1 и TASK-3 на плазматической мембране. Понижающая регуляция TASK-1 с помощью SGK, вероятно, способствует патогенезу хронической ФП и обеспечивает механистическую связь между повышенными уровнями минералокортикоидов и снижением TASK-1, ответственным за отбеливание бурой жировой ткани. Поскольку каналы TASK-1, по-видимому, участвуют в патогенезе многих заболеваний, включая обструктивное апноэ во сне и легочную гипертензию, многообещающим является изучение зависимой от стресс-киназы регуляции этих каналов в различных патофизиологических условиях.

Благодарности

Мы благодарим Оксану Новак за прекрасную техническую поддержку и Томаса Дрэбинга за записи с зажимом напряжения. Эта работа была поддержана Kempkes Stiftung (грант 12/08 для ND) и грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft DE-1482/2-1 и DE-1482/3-1 для ND, частично исследовательскими грантами Гейдельбергского университета. , Медицинский факультет (стипендия Рахель Гойтен-Штраус и стипендия Олимпия-Мората для CS), от DZHK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований; грант Excellence Grant для CS), от Немецкого фонда сердца / Немецкого фонда исследований сердца (F / 41) /15 до CS), от Deutsche Forschungsgemeinschaft (Немецкий исследовательский фонд; SCHM 3358/1-1 до CS), Universitätsklinikum Gießen and Marburg (UKGM) до S.R. и Anneliese Pohl Stiftung в S.R.

Заявление о раскрытии информации

Не заявлено.

Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License (CC BY-NC-ND). Использование и распространение в коммерческих целях, а также любое распространение измененного материала требует письменного разрешения. Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством. Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам.