Температура вирус: КАК ПОБЕДИТЬ ОРЗ И ГРИПП

Высокая относительная влажность (> 95%) при сравнительно низкой температуре (28 ° C и 33 ° C) существенно не повлияла на инфекционность вируса (рис. 2 (а)). Высокая температура (38 ° C) при относительной влажности 80–90% привела к потере 0,25 ~ 2 титра через 24 часа (рис. 2 (b)). Однако, если высушенный вирус хранился при высокой температуре (38 ° C) и высокой относительной влажности (> 95%), наблюдалась дополнительная потеря титра ~ 1,5 для каждой временной точки до 24 часов (0,38 ~ 3,38) при сравнении. с высокой температурой (38 ° C) при более низкой относительной влажности 80–90% (Рисунки 3 (a) –3 (c)).

4. Обсуждение

Вирусы не размножаются за пределами живой клетки, но инфекционный вирус может сохраняться на загрязненных поверхностях окружающей среды, а на продолжительность существования жизнеспособного вируса заметно влияют температура и влажность. Загрязненные поверхности, как известно, являются важными переносчиками инфекций как в больницах, так и среди населения. Роль фомитов в передаче RSV была четко продемонстрирована [20]. Выживаемость вирусов на различных фомитах изучалась для вирусов гриппа, парамиксовирусов, поксвирусов и ретровирусов [21].Сообщалось, что человеческий коронавирус, связанный с простудой, оставался жизнеспособным только в течение 3 часов на поверхностях окружающей среды после высыхания, хотя он остается жизнеспособным в течение многих дней в жидкой суспензии [13]. Вирусы парагриппа и RSV были жизнеспособны после высыхания на поверхности в течение 2 и 6 часов соответственно [20, 22]. В аэрозольной форме коронавирус человека 229E обычно менее стабилен при высокой влажности [12]. Стабильность SCoV в окружающей среде ранее была неизвестна, и эта информация, несомненно, важна для понимания механизмов передачи этого вируса в больницах и общинах.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что SARS CoV может выжить как минимум две недели после высыхания в условиях температуры и влажности, характерных для окружающей среды с кондиционированием воздуха. Вирус стабилен в течение 3 недель при комнатной температуре в жидкой среде, но его легко убить нагреванием при 56 ° C в течение 15 минут [9]. Это указывает на то, что SARS CoV является стабильным вирусом, который потенциально может передаваться при непрямом контакте или фомитах. Эти результаты могут указывать на то, что загрязненные поверхности могут играть важную роль в передаче инфекции в больнице и в обществе.

Наши исследования показывают, что SCoV относительно более стабилен, чем коронавирусы человека 229E или OC43 и некоторые другие респираторные респираторные патогены, такие как респираторно-синцитиальный вирус. Эти результаты предполагают, что, хотя прямая капельная передача является важным путем передачи [23], роль фомитов и загрязнения окружающей среды в передаче вируса может играть значительную роль в передаче вируса. В частности, фомиты могут способствовать продолжающейся передаче инфекции в нозокомиальных условиях, которая продолжает происходить, несмотря на большое внимание и строгие меры предосторожности, принимаемые для предотвращения распространения капель.В дополнение к мерам предосторожности, касающимся капель, необходимо усилить меры предосторожности при контакте и мытье рук.

Фекальное заражение коронавирусом SCoV может, таким образом, быть эффективным путем передачи болезни. Вспышка в Сямэнь Гарден в Гонконге, затронувшая более 300 жителей одноквартирного дома, предположительно была передана через загрязненные сточные воды. Стабильность вируса на поверхностях окружающей среды и его присутствие в фекалиях указывает на возможность того, что фекальное загрязнение производства свежих продуктов питания может представлять угрозу для передачи вируса; особенно в странах с плохими системами санитарии и отвода сточных вод и необходимыми исследованиями для рассмотрения этой возможности.

В этом исследовании мы показали, что высокая температура при высокой относительной влажности имеет синергетический эффект на инактивацию жизнеспособности SARS CoV, в то время как более низкие температуры и низкая влажность способствуют продлению выживания вируса на зараженных поверхностях. Таким образом, условия окружающей среды в таких странах, как Малайзия, Индонезия и Таиланд, не способствуют длительному выживанию вируса. В таких странах, как Сингапур и Гонконг, где интенсивно используется кондиционирование воздуха, передача инфекции в основном происходила в хорошо кондиционированных помещениях, таких как больницы или отели.Кроме того, отдельное исследование показало, что во время эпидемии риск ежедневного повышения заболеваемости атипичной пневмонией был в 18,18 раз выше в дни с более низкой температурой воздуха, чем в дни с более высокой температурой в Гонконге [24] и других регионах [15]. –17]. Взятые вместе, эти наблюдения могут объяснить, почему в некоторых азиатских странах в тропической зоне (с высокой температурой и высокой относительной влажностью), таких как Малайзия, Индонезия и Таиланд, не было внутрибольничных вспышек SARS (Таблицы 1 и 2 (a) –2 (c )). Это также может объяснить, почему в Сингапуре, который также находится в тропической зоне (таблица 2 (d)), большинство вспышек атипичной пневмонии происходило в больницах (с кондиционированием воздуха).Интересно, что во время вспышки атипичной пневмонии в Гуанчжоу врачи держали окна в палатах открытыми и хорошо вентилировались, что вполне могло снизить выживаемость вируса и снизить внутрибольничную передачу. SARS CoV может сохранять свою инфекционность до 2 недель при низкой температуре и низкой влажности окружающей среды, что может способствовать передаче вируса в обществе, как в Гонконге, который расположен в субтропической зоне (таблица 2 (e)). Также следует учитывать другие факторы окружающей среды, включая скорость ветра, дневной солнечный свет и давление воздуха, которые, как было показано, связаны с эпидемией атипичной пневмонии [16, 17].Динамика эпидемии атипичной пневмонии включает множество факторов, включая физические свойства вируса, внешнюю и внутреннюю среду, гигиену, пространство и генетические предрасположенности [10, 15–17, 24, 25]. Понимание стабильности вирусов в различных условиях температуры и влажности важно для понимания передачи нового инфекционного агента, включая недавний апандемический грипп h2N12009.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Различная зависимая от температуры динамика вирус-хозяин для SARS-CoV-2 и SARS-CoV в респираторном эпителии человека

Abstract

С момента своего появления в декабре 2019 года тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2 (SARS-CoV-2), распространился по всему миру и стал серьезным бременем для общественного здравоохранения.Несмотря на свою тесную филогенетическую связь с SARS-CoV, SARS-CoV-2 демонстрирует повышенную динамику передачи от человека к человеку, вероятно, из-за эффективной ранней репликации в эпителии верхних дыхательных путей инфицированных людей. Поскольку было показано, что разные температуры в верхних и нижних дыхательных путях человека (33 ° C и 37 ° C соответственно) влияют на кинетику репликации нескольких респираторных вирусов, а также на динамику врожденного иммунного ответа хозяина, мы исследовали влияние температура на инфекции SARS-CoV-2 и SARS-CoV с использованием модели первичной культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека.SARS-CoV-2, в отличие от SARS-CoV, реплицировался с более высокими титрами, когда заражение проводилось при 33 ° C, а не 37 ° C. Хотя оба вируса были очень чувствительны к предварительной обработке интерфероном типа I и типа III, подробный анализ транскриптома с временным разрешением выявил температурно-зависимые интерфероновые и провоспалительные реакции, вызванные SARS-CoV-2, которые были обратно пропорциональны его эффективности репликации при 33 °. C или 37 ° C. Эти данные дают критически важное представление о динамике взаимодействия вируса с хозяином и соответствуют характерным клиническим характеристикам SARS-CoV-2 и SARS-CoV, а также об эффективности их передачи.

Образец цитирования: Вьковски П., Гултом М., Келли Дж. Н., Штайнер С., Рассел Дж., Мангит Б. и др. (2021) Несопоставимая зависимая от температуры динамика вирус-хозяин для SARS-CoV-2 и SARS-CoV в респираторном эпителии человека. ПЛоС Биол 19 (3): e3001158. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158

Академический редактор: Кен Кэдвелл, Школа медицины Нью-Йоркского университета, США

Поступила: 14 января 2021 г .; Одобрена: 25 февраля 2021 г .; Опубликован: 29 марта 2021 г.

Авторские права: © 2021 V’kovski et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Данные транскриптомов были депонированы в общедоступном репозитории с открытым доступом Arrayexpress из Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI) под E-MTAB-9781, а скрипты, используемые для анализа и создания рисунков, будут доступны через наш Репозиторий Github (https: // github.com / ИФИК-вирусология).

Финансирование: Авторы получили финансирование из следующих источников: Европейская комиссия (Сеть инновационного обучения Марии Склодовской-Кюри «HONORS»; соглашение о гранте № 721367) для VT и RD (https://cordis.europa.eu/project / id / 721367), Швейцарский национальный научный фонд (SNSF) предоставляет 179260 RD (http://p3.snf.ch/project-179260), 173085 VT (http://p3.snf.ch/project- 173085), 31CA30_196644 в VT и RD, (http://p3.snf.ch/project-196644), Национальный центр компетенции в исследованиях (NCCR) по РНК и заболеваниям в VT (https: // nccr-rna-and -болезнь.ch /), Федеральное министерство образования и исследований Германии (BMBF), грант RAPID (01KI1723A) VT и RD. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Сокращения: ACE2, ангиотензин-превращающий фермент 2; Али, граница раздела воздух-жидкость; BRB-seq, Массовое штрих-кодирование и секвенирование РНК; COVID-19, Коронавирус заболевание 2019; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; DE, дифференциально выраженный; FBS, фетальная бычья сыворотка; ФК, изменение кратности; FDR, коэффициент ложного обнаружения; GSEA, анализ обогащения набора генов; hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; HBSS, Сбалансированный солевой раствор Хэнкса; hpi, часы после заражения; IFN, интерферон; ЕСЛИ ЭТО, индуцированные интерфероном белки с тетратрикопептидными повторами; ISG, IFN-стимулированный ген; LRT, Тест отношения правдоподобия; МОИ, множественность заражения; OASL, Подобная 2′-5’-олигоаденилатсинтетазе; PFU, бляшкообразующий агрегат; PRR, рецептор распознавания образов; SARS-CoV-2, Тяжелый острый респираторный синдром Коронавирус 2; scRNA-seq, одноклеточное РНК-секвенирование; UMAP, Аппроксимация и проекция равномерного многообразия; UMI, уникальный идентификатор молекулы; VST, дисперсионно-стабилизирующее преобразование; VTM, транспортная среда вируса

Введение

Зоонозный коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) впервые появился в Ухане, провинция Хубэй, Китай, в декабре 2019 года и вскоре был признан этиологическим агентом коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19). .На сегодняшний день пандемия COVID-19 привела к более 115 миллионам лабораторно подтвержденных случаев во всем мире, в том числе более 2,5 миллиона смертей [1–4]. Интересно, что SARS-CoV-2 имеет тесную филогенетическую связь с SARS-CoV, другим коронавирусом, который появился в 2002/2003 году и привел к более чем 8000 подтвержденным случаям и 800 смертельным исходам [5]. SARS-CoV-2 отличается от SARS-CoV всего на 380 аминокислот и сохраняет высокий уровень консервативности известных рецептор-связывающих мотивов, которые взаимодействуют с человеческим рецептором ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2) [6].Более того, хотя было показано, что рецептор клеточной поверхности ACE2 и сериновая протеаза TMPRSS2 служат детерминантами входа как для SARS-CoV, так и для SARS-CoV-2 [2,7–9], накопление доказательств показывает, что 2 вируса демонстрируют отчетливую динамику передачи от человека к человеку и следуют различным клиническим курсам инфекции. Эти различия между SARS-CoV и SARS-CoV-2 убедительно свидетельствуют о наличии несопоставимой динамики вирус-хозяин во время вирусной инфекции в респираторном эпителии человека [10–15].

Проводящие дыхательные пути человека выстланы псевдостратифицированным, реснитчатым и столбчатым эпителием, который содержит бокаловидные клетки, продуцирующие муцин, и представляет собой решающий барьер для сдерживания вторжения патогенов. Ранее было показано, что анатомическое расстояние между верхними и нижними дыхательными проводящими путями и их разные температуры окружающей среды (от 32 до 33 ° C и 37 ° C соответственно [16,17]) влияют на кинетику репликации различных респираторных вирусов, таких как риновирусы, вирусы гриппа и коронавирусы [18–22].Более того, анатомические различия в температуре окружающей среды также влияют на динамику иммунного ответа вирус – хозяин и, таким образом, на динамику потенциальной передачи от человека к человеку [23]. Интересно, что SARS-CoV-2 был обнаружен раньше после заражения и более широко, чем SARS-CoV в тканях верхних дыхательных путей инфицированных пациентов [10,13,14,24,25], что позволяет предположить, что кинетика передачи и динамика врожденного иммунного ответа хозяина в инфицированные ткани могут различаться между инфекциями SARS-CoV и SARS-CoV-2.

Здесь мы использовали модель культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека (hAEC) для исследования влияния различных температур инкубации на кинетику репликации вируса и динамику иммунного ответа хозяина при инфекциях SARS-CoV и SARS-CoV-2. Наше исследование показало, что репликация SARS-CoV-2 улучшилась в культурах hAEC, инкубированных при 33 ° C, а не при 37 ° C, и что более высокие инфекционные титры были получены из культур, инфицированных SARS-CoV-2, чем культур hAEC, инфицированных SARS-CoV при 33 ° C. ° C.И SARS-CoV, и SARS-CoV-2 одинаково эффективно реплицировались в культурах hAEC при 37 ° C. Предварительная обработка культур hAEC экзогенным интерфероном I и III типа (IFN) при различных температурах показала, что SARS-CoV-2 и SARS-CoV очень чувствительны к IFN как I, так и III типа, что свидетельствует о значимости ранней передачи сигналов IFN и врожденного иммунитета. ответы на ограничение вирусной инфекции. Важно отметить, что подробный анализ временного транскриптома инфицированных культур hAEC подтвердил первоначальные данные и выявил характерные сигнатуры генов врожденного иммунного ответа, обратно коррелирующие с эффективностью вирусной репликации SARS-CoV-2 при различных температурах окружающей среды.В целом, эти результаты дают глубокое фундаментальное представление о динамике врожденного иммунного ответа вирус – хозяин SARS-CoV-2 и тесно филогенетически родственного SARS-CoV в респираторном эпителии и совпадают с клиническими характеристиками и эффективностью передачи обоих вирусов.

Результаты

Кинетика репликации SARS-CoV-2 и SARS-CoV при 33 ° C и 37 ° C

чАЕС представляют собой хорошо охарактеризованную модель in vitro, которая морфологически и функционально воспроизводит эпителиальную выстилку дыхательных путей человека in vivo.Культуры hAEC от 7 разных доноров-людей были заражены изолятами SARS-CoV-2 / München-1.1 / 2020/929 или SARS-CoV Frankfurt-1 с использованием множественности инфекции (MOI) 0,1. Инфицированные культуры hAEC инкубировали при 33 ° C или 37 ° C на протяжении всего эксперимента для оценки влияния колебаний температуры, происходящих в дыхательных путях человека, и на динамику взаимодействия вируса и хозяина, ассоциированного с моделью. Полярность высвобождения вирусного потомства контролировали путем сбора апикальных смывов и базолатеральной среды с 24-часовыми интервалами в течение 96 часов.При 37 ° C SARS-CoV и SARS-CoV-2 реплицировались с аналогичными титрами в течение инфекции (рис. 1A и 1B). Интересно, что при оценке репликации вируса при 33 ° C, а не при 37 ° C, было очевидно, что инфекция SARS-CoV-2 привела к 10-кратному увеличению титров, высвобождаемых в апикальном компартменте между 72 и 96 часами после заражения (hpi). Напротив, репликация SARS-CoV при 33 ° C оставалась аналогичной репликации при 37 ° C и не показала значительных различий на протяжении всего курса инфекции (рис. 1A и 1B).Поскольку направленность высвобождения вирусного потомства имеет решающее значение для последующего распространения вируса и общего исхода заболевания, также оценивали базолатеральное высвобождение SARS-CoV и SARS-CoV-2. Подобно тому, что мы и другие наблюдали ранее для всех других коронавирусов человека, SARS-CoV и SARS-CoV-2 преимущественно выделялись на поверхность просвета (S1A и S1B Fig) [26,27].

Рис. 1. Кинетика репликации SARS-CoV и SARS-CoV-2 в культурах hAEC.

Хорошо дифференцированные культуры hAEC инфицировали SARS-CoV ( a ) и SARS-CoV-2 ( b ) с использованием 30000 БОЕ или оставались неинфицированными (имитация) и инкубировали при 37 ° C или 33 ° C.Инокулированный вирус удаляли при 1 hpi и промывали апикальную сторону. Далее культуры инкубировали при указанной температуре. В указанное время после инфицирования апикальное высвобождение вируса оценивали титрованием бляшек ( a, b ). Данные представляют собой среднее значение ± 95% ДИ культур чАЕС от 7 различных доноров-людей. Отдельные точки представляют собой среднее значение 2 технических повторов. Значения при 0 hpi указывают на титр инокулята, использованного для заражения культур hAEC, а значения при 1 hpi указывают на оставшийся титр после третьей промывки.Значения p были вычислены с использованием двусторонних парных выборочных тестов t . При 96 hpi культуры hAEC фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресцентного анализа с использованием антител против белка нуклеокапсида SARS-CoV (зеленый), β-тубулина (реснички, красный), ZO-1 (плотные контакты, белый) и DAPI (синий) ( с ). Показаны репрезентативные z-проекции одного донора. Масштабная линейка 20 мкм. Зараженные клетки определяли количественно после сегментации отдельных клеток на основе окрашивания ZO-1 и измерения средней интенсивности окрашивания белка нуклеокапсида ( d ).Данные представляют собой среднее значение ± 95% ДИ нескольких изображений, полученных из культур чАЕС, полученных от 4 разных доноров-людей. В среднем было проанализировано более 10 ⁴ клеток на донора и на одно состояние. Данные, лежащие в основе этого рисунка, находятся в S1 Data. hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; hpi, часы после заражения; PFU, блок формирования налета; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3001158.g001

Чтобы оценить, являются ли наблюдаемые различия в эффективности репликации в зависимости от температуры результатом количества клеток, инфицированных SARS-CoV или SARS-CoV-2, культуры hAEC были зафиксированы на уровне 96 hpi и обработаны для иммунофлуоресцентного анализа с использованием антител, направленных против белка нуклеокапсида SARS-CoV. Кроме того, чтобы выявить потенциальный предпочтительный тропизм вируса к определенному типу клеток, также были включены характерные маркеры архитектуры культур hAEC, такие как межклеточные плотные соединения (ZO-1) и реснички (β-тубулин).Микроскопические исследования и автоматическая количественная оценка изображений показали, что одновременно с более эффективной кинетикой репликации SARS-CoV-2 при 33 ° C доля клеток, инфицированных SARS-CoV-2, значительно увеличивалась при 33 ° C по сравнению с 37 ° C и доля клеток, инфицированных SARS-CoV, осталась одинаковой при 33 ° C и 37 ° C. Оба вируса показали сопоставимую фракцию инфицированных клеток при 37 ° C (рис. 1C и 1D). Примечательно, что при 72 и 96 hpi большинство антиген-положительных клеток SARS-CoV и SARS-CoV-2 не были связаны с маркером β-тубулина и поэтому были квалифицированы как клетки без ресничек (рис. 1C и 2C).Ранее мы наблюдали, что SARS-CoV инфицирует как популяции клеток с ресничками, так и без ресничек [26]. Однако, учитывая, что другие отчеты показывают, что SARS-CoV в первую очередь нацелен на реснитчатые клетки [28], мы проанализировали локализацию входного рецептора, ACE2 и маркеров β-тубулина с помощью микроскопии. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что ACE2 экспрессируется как в популяциях реснитчатых, так и в нецилиндрических клетках в неинфицированных культурах hAEC (S2A фиг.). В соответствии с этим, анализ экспрессии мРНК в неинфицированных культурах hAEC с использованием секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) подтвердил, что мРНК ACE2 и TMPRSS2 обнаружены как в популяциях секреторных, так и в реснитчатых клетках (S2B-S2D Рис) [29].В совокупности эти результаты демонстрируют, что, несмотря на общую потребность в ACE2 и TMPRSS2 для проникновения в клетки-хозяева, SARS-CoV и SARS-CoV-2 демонстрируют сильные температурно-зависимые вариации кинетики репликации в культурах hAEC, что позволяет предположить наличие детерминант хозяина, вмешивающихся во время пост- начальные этапы жизненного цикла вируса. Важно отметить, что значительно усиленная репликация SARS-CoV-2 при 33 ° C, вероятно, поддерживает усиленную репликацию в верхних дыхательных путях и трансмиссивность SARS-CoV-2 по сравнению с SARS-CoV.

Чувствительность SARS-CoV-2 и SARS-CoV к IFN

Количество вирусного потомства, высвобождаемого из инфицированных клеток, представляет собой динамическое взаимодействие между репликацией вируса и его ингибированием клеточными защитными механизмами, такими как различные типы генов, стимулированных интерфероном (ISG). Чтобы проверить, влияет ли индукция ISG при стимуляции интерфероном по-разному на репликацию SARS-CoV и SARS-CoV-2, культуры hAEC предварительно обрабатывали 50 или 5 МЕ экзогенного интерферона I типа (IFN-αA / D) и 50 или 5 нг. интерферона типа III (IFN-3) за 18 часов до инфицирования при 33 ° C или 37 ° C.После этого культуральную среду hAEC заменяли средой без IFN, и клетки инфицировали SARS-CoV и SARS-CoV-2 при MOI 0,1 при 33 ° C или 37 ° C в течение 72 часов. Титрование высвобожденного апикально вируса показало, что репликация SARS-CoV-2 и SARS-CoV сильно ограничена при предварительной обработке 50 МЕ типа I или 50 нг интерферона типа III при 33 ° C или 37 ° C (рис. 2А). Хотя, как и в ранее опубликованных наблюдениях [26], SARS-CoV казался менее чувствительным к IFN типа I, чем к предварительной обработке IFN типа III при 37 ° C (Рис. 2A, 24 hpi).Однако эти различия не были статистически значимыми, что было дополнительно подтверждено предварительной обработкой 5 МЕ IFN типа I или 5 нг IFN типа III (рис. 2B). Соответственно, SARS-CoV демонстрировал аналогичную чувствительность к предварительной обработке IFN типов I и III при 33 ° C (рис. 2A и 2B). В соответствии с этими результатами SARS-CoV-2 был одинаково чувствителен к обеим дозам предварительной обработки IFN типа I или III при 33 ° C или 37 ° C (рис. 2A и 2B). Примечательно, что ограничение SARS-CoV-2 после предварительной обработки 5 МЕ типа I и 5 нг ИФН типа III умеренно уменьшилось через 72 hpi (рис. 2B).

Рис. 2. Репликация SARS-CoV и SARS-CoV после предварительной обработки IFN-I и IFN-III.

культур hAEC обрабатывали с базолатеральной стороны рекомбинантным универсальным IFN типа I (50 или 5 МЕ) или рекомбинантным IFN-λ3 (50 или 5 нг) в течение 18 часов. Перед инфицированием среду удаляли и заменяли средой без IFN, и культуры hAEC инфицировали SARS-CoV и SARS-CoV-2 с использованием 30 000 БОЕ и инкубировали при 37 ° C или 33 ° C. Инокулированный вирус удаляли при 1 hpi и промывали апикальную сторону.Далее культуры инкубировали при указанной температуре. В указанное время апикальное высвобождение вируса оценивали титрованием бляшек ( a, b ). Данные представляют собой среднее значение ± 95% ДИ культур чАЕС от 3 разных доноров-людей. Отдельные точки представляют 1 (b) или среднее значение 2 технических повторов (a). Значения при 0 hpi указывают на титр инокулята, использованного для заражения культур hAEC, а значения при 1 hpi указывают на оставшийся титр после третьей промывки. Значения p были вычислены с использованием двусторонних парных выборочных тестов t .Данные, лежащие в основе этого рисунка, находятся в S1 Data. При 72 hpi, культуры hAEC, предварительно обработанные 50 МЕ IFN типа I или 50 нг IFN типа III, фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресцентного анализа с использованием антител против белка нуклеокапсида SARS-CoV (зеленый), β-тубулина (реснички, красный), ZO-1 (плотные соединения, белый) и DAPI (синий) ( c ). Показаны репрезентативные z-проекции 1 донора. Масштабная линейка 20 мкм. hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; hpi, часы после заражения; ИФН, интерферон; PFU, блок формирования налета; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.g002

Снижение титров вирусных потомков в обоих условиях предварительной обработки IFN было подтверждено иммунофлуоресцентным анализом при 72 hpi. Вирусные антигены больше не выявлялись при иммуноокрашивании культур hAEC, предварительно обработанных IFN типа I или III, антителами к нуклеокапсидному белку против SARS-CoV (рис. 2C). В целом, эти результаты предполагают, что кинетика вирусной репликации как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2 в верхних и нижних дыхательных путях сильно зависит от врожденных иммунных ответов, вызванных IFN типа I и III, и что мощный ответ IFN может эффективно ограничивать вирусная репликация SARS-CoV-2 в первичных высокодифференцированных культурах hAEC.

Несопоставимые ответы хозяина на SARS-CoV и SARS-CoV-2 в культурах hAEC

Учитывая поразительное влияние температуры на кинетику репликации SARS-CoV-2 (рис. 1) и снижение вирусной нагрузки после предварительной обработки IFN (рис. 2), мы затем попытались изучить, как различия в температуре могут влиять на транскрипционный ответ хозяина на SARS. -CoV и SARS-CoV-2. С этой целью клеточная РНК была экстрагирована из культур hAEC, инфицированных либо SARS-CoV, либо SARS-CoV-2 (MOI 0.1), а также из неинфицированных культур чАЕС при 24, 48, 72 и 96 hpi (рис. 1). Затем образцы секвенировали для анализа транскриптома с использованием протокола массового штрих-кодирования и секвенирования РНК (BRB-seq) до глубины необработанного секвенирования 12 миллионов считываний на образец [30]. Эта глубина секвенирования использовалась для обеспечения того, чтобы все образцы были секвенированы до насыщения и что гены с более низкими уровнями экспрессии были включены в анализ, как показано на рис. S3. Проверка количества вирусов SARS-CoV и SARS-CoV-2. риды продемонстрировали, что их уровни экспрессии соответствовали кинетике репликации вируса при 33 ° C и 37 ° C, описанной на фиг. 1 (S4 фиг.).Последующий анализ дифференциально экспрессируемых (DE) генов хозяина в наборах данных был выполнен с использованием 3 различных подходов для (i) выявления глобальных различий между инфекциями SARS-CoV и SARS-CoV-2, вызванных только температурой, а также (ii) индивидуального попарного анализа. сравнения между каждым вирусом и его неинфицированным аналогом в разные моменты времени и при различных температурах и (iii) выполнение временного анализа для идентификации генов DE, которые меняются с течением времени.

Для первого анализа гена DE объединенные данные от 7 биологических доноров были нормализованы и разделены только по температуре, чтобы выявить глобальные изменения в экспрессии генов в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2, по сравнению с неинфицированными культурами hAEC при 33 °. С и 37 ° С.Этот подход выявил в общей сложности 126 генов DE для инфекций SARS-CoV при 33 ° C, 2 гена DE для инфекций SARS-CoV при 37 ° C, 161 ген DE для инфекций SARS-CoV-2 при 33 ° C и 82 DE. гены для инфекций SARS-CoV-2 при 37 ° C (Log ₂ FC ≥ 1,5, FDR ≤ 0,1), представленные в общей сложности 276 уникальными генами (таблица S1). Сравнение генов DE, идентифицированных при разных температурах для каждого вируса, выявило несколько кластеров генов, которые были специфичны для инфекции SARS-CoV или SARS-CoV-2, а другие были общими для разных состояний (рис. 3A).Анализ обогащения путей отдельных кластеров генов показал, что 43 гена DE, общие для инфекций SARS-CoV и SARS-CoV-2 при 33 ° C, преимущественно связаны с путями трансляции мРНК эукариот, тогда как специфические гены для инфекции SARS-CoV при 33 ° C. ° C в основном связаны с сигнальными путями хемокинов (рис. 3B и таблица S2). Напротив, гены DE, идентифицированные для инфекций SARS-CoV-2 как при 33 ° C, так и при 37 ° C, в основном были связаны с противовирусным ответом хозяина (рис. 3B).

Рис. 3. Зависящий от температуры транскрипционный ответ хозяина в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2.

Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между генами DE, идентифицированными в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV (фиолетовый) и SARS-CoV-2 (оранжевый), при 33 ° C или 37 ° C ( a ). Карта обогащения, иллюстрирующая результаты анализа пути обогащения для кластеров генов DE, идентифицированных в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2, при температуре 33 ° C или 37 ° C. Размер круга представляет количество генов, связанных с данным путем ( b ).Иерархический кластерный анализ генов DE, идентифицированных в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2, при 33 ° C или 37 ° C по сравнению с неинфицированными культурами hAEC (Mock). Уровни экспрессии для отдельных генов DE показаны в строках в виде логарифма ₂ средних нормализованных подсчетов для всех 7 доноров-людей, стратифицированных по условиям, температуре и hpi (столбцы; характерные цвета показаны в легендах). 40 из 45 генов DE, уникальных для SARS-CoV-2 при 33 ° C и 37 ° C, показаны справа (ось y) ( c ).Точечная диаграмма, иллюстрирующая анализ обогащения путей, выполненный на 16 различных профилях гена DE. Значительно обогащенные пути для SARS-CoV и SARS-CoV-2 показаны для температур инкубации 33 ° C и 37 ° C при 72 и 96 hpi. Точки были скорректированы по размеру и цвету, чтобы проиллюстрировать соотношение генов, и скорректировано значение p (<0,05) для данного пути, соответственно ( d ). Графики коробчатой ​​диаграммы, показывающие распределение распространенности Z-баллов от генов DE, связанных с кластером 1, 2 и 3, при разных hpi для Mock (зеленый), SARS-CoV (фиолетовый) и SARS-CoV-2 (оранжевый) для обоих 33 ° C и 37 ° C.Общая средняя численность по Z-баллу с течением времени для каждого состояния обозначена сплошной линией ( e ). Карта обогащения, иллюстрирующая анализ обогащения путей для временных генов DE, идентифицированных в инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2 и неинфицированных (имитирующих) культурах hAEC при 33 ° C или 37 ° C. Размер круга представляет количество генов, связанных с данным путем ( f ). ДЭ, дифференциально выраженная; hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; hpi, часы после заражения; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.g003

Чтобы идентифицировать гены DE, которые могут быть важны в определенные моменты времени, мы затем разделили объединенные нормализованные данные как по температуре, так и по времени и провели попарные сравнения между SARS. -CoV-2 или SARS-CoV и соответствующие им неинфицированные образцы при каждой температуре и времени. Интересно, что этот анализ показал, что независимо от температуры и времени перекрытие между ответом хозяина, индуцированным каждым вирусом, было относительно низким, и что большинство генов DE для SARS-CoV-2 присутствовали на 48 и 96 hpi для 33 ° C и 72 и 96. hpi для 37 ° C (Log ₂ FC ≥ 1.5, FDR ≤ 0,1), в то время как для SARS-CoV большинство генов DE было идентифицировано при 48 hpi для 33 ° C, что составляет 226 из 401 идентифицированного уникального гена (рис. S5A – S5D и таблица S3). Аналогичная тенденция наблюдалась, когда парные сравнения проводились непосредственно между образцами SARS-CoV-2 и SARS-CoV. Примечательно, что эти результаты показали, что наиболее контрастные различия между SARS-CoV и SARS-CoV-2 произошли при 96 hpi для 33 ° C, тогда как они произошли при 72 hpi для 37 ° C (S5E и S5F Fig и S4 Table). Для дальнейшего изучения этих результатов мы выполнили иерархическую кластеризацию с 401 уникальным идентифицированным геном DE и аннотировали 40 из 45 генов DE, которые также оказались специфичными для инфекции SARS-CoV-2 при температуре 33 ° C и 37 ° C от глобальный анализ (рис. 3A и 3C).Кроме того, чтобы установить, значительно ли модулируются определенные биологические пути при различных температурах, был проведен анализ обогащения путей для всех уникальных кластеров генов DE, обнаруженных в парных сравнениях для SARS-CoV или SARS-CoV-2. В целом, эти результаты выявили отчетливый температурно-зависимый ответ хозяина на SARS-CoV-2 на 72 и 96 hpi, включая обогащение различных IFN и антивирусных сигнальных генов и путей (рис. 3C и 3D). Примечательно, что ни один из этих противовирусных генов или путей не был значительно обогащен во время инфекции SARS-CoV.

После анализа попарной кластеризации, который напрямую сравнивает инфекции SARS-CoV или SARS-CoV-2 с неинфицированными культурами hAEC в каждый отдельный момент времени, мы также выполнили глобальный временной анализ DE, который адаптирован для выявления значительных изменений экспрессии генов с течением времени. . Этот анализ выявил в общей сложности 98 генов DE (FDR ≤ 0,1), представляющих 70 генов с повышенной активностью и 28 генов с пониженной регуляцией, которые попали в 3 отдельных иерархических кластера генов (рис. 3E и таблица S5). Большинство генов DE в кластерах 1, 2 и 3, по-видимому, связаны с передачей сигналов IFN, трансляцией эукариотической мРНК или путями респираторного транспорта электронов соответственно (рис. 3F).Более тщательное изучение изменений уровня экспрессии гена DE с течением времени показало, что только гены, связанные с кластером 1 (передача сигналов IFN), демонстрируют четкий временной и температурно-зависимый паттерн экспрессии. Интересно, что для инфекций SARS-CoV-2 экспрессия этих генов увеличивалась среди всех 7 доноров уже через 48 hpi при 37 ° C, но не при 33 ° C (рис. 3E). Этот результат был менее очевиден для SARS-CoV, который показал лишь незначительное увеличение экспрессии 29 генов DE, связанных с передачей сигналов IFN, при 96 hpi при 37 ° C (рис. 3E).

Вместе эти результаты показывают, что близкородственные вирусы SARS-CoV и SARS-CoV-2 вызывают несопоставимые и зависящие от температуры ответы хозяина в культурах hAEC, которые меняются со временем и коррелируют с их фенотипами репликации при 33 ° C и 37 ° C. Более того, в отличие от SARS-CoV, SARS-CoV-2 вызывал выраженный противовирусный и провоспалительный ответ в первичных культурах эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Эти ответы возникли раньше и были сильнее индуцированы при 37 ° C по сравнению с 33 ° C и совпали с повышенной репликацией SARS-CoV-2 при температурах, соответствующих эпителию верхних дыхательных путей (33 ° C).

Врожденные иммунные ответы на SARS-CoV и SARS-CoV-2 в культурах hAEC

Чтобы получить более полное представление о динамике врожденных иммунных ответов на инфекции SARS-CoV и SARS-CoV-2, мы исследовали уровни экспрессии 29 генов DE, обнаруженных в кластере 1 нашего временного анализа, которые были связаны с сигнальными путями IFN. (кластер 1 на рис. 3E и 3F). Эти гены DE были нанесены на график вместе с 401 геном, идентифицированным в наших предыдущих парных сравнениях SARS-CoV и SARS-CoV-2 как при 33 ° C, так и при 37 ° C (S6, рис.).Это подчеркнуло, что CXCL10 и CXCL11 , хемокины, ответственные за рекрутирование иммунных клеток в очаг инфекции из кровотока, входят в основную группу из 29 генов DE и могут быть обнаружены при обеих температурах, хотя повышающая регуляция была сильнее при 37 ° C по сравнению с 33 ° C. И наоборот, во время инфекций SARS-CoV-2 не наблюдалось повышения регуляции канонических провоспалительных генов, таких как TNF , IL-11 , IL-18, , IL-6, и IL1B . культур hAEC (S7A и S7B фиг.).Рецептор распознавания образов (PRR) RIG-I / DDX58 и интерферон-индуцируемый 2′-5′-олигоаденилатсинтетазеподобный белок ( OASL ) и 3 члена интерферон-индуцированных белков с тетратрикопептидными повторами (IFIT) были также идентифицированы как одни из наиболее известных генов DE, которые показали более раннюю и более высокую экспрессию при 37 ° C во время инфекций SARS-CoV-2 (рис. 3C и S6, рис.). Кроме того, анализ обогащения набора генов (GSEA) выявил высокую степень взаимосвязанности между генами DE, связанными с различными обогащенными IFN и противовирусными сигнальными путями, что еще больше подчеркивает важность противовирусного ответа хозяина во время инфекции SARS-CoV-2 (рис. 4A). .

Рис. 4. Врожденный иммунный ответ в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2.

Сетевой график генной концепции, иллюстрирующий индивидуальные взаимоотношения между временными генами DE из кластера 1 (передача сигналов IFN) и 5 ​​верхних значительно обогащенных биологических процессов. Концентраторы обогащенного пути (окрашенные биологическим процессом) были скорректированы по размеру, чтобы отразить количество генов, связанных с каждым соответствующим путем, тогда как для отдельных генов их взаимосвязь окрашена соответствующим биологическим процессом ( a ).Гистограмма, показывающая средние нормализованные уровни экспрессии с течением времени для IFNL1 , IFNL2 , IFNL3 и IFNB1 при соответствующих температурах для неинфицированных (фиктивных) культур hAEC (две верхние панели) и для SARS-CoV ( две средние панели) и SARS-CoV-2 (две нижние панели) инфицировали культуры hAEC. Цвет столбиков был изменен, чтобы проиллюстрировать соответствующее SD среди доноров ( b ). Данные, лежащие в основе этого рисунка, находятся в S1 Data. ДЭ, дифференциально выраженная; hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; ИФН, интерферон; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2; SD, стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.g004

Ранее мы наблюдали в контексте вируса гриппа Ah2N1pdm09, что только небольшая часть инфицированных клеток продуцирует IFN во время инфекции [31]. Поскольку большинство активированных генов DE во время инфекции SARS-CoV-2 были генами, индуцированными ниже по ходу пути IFN, мы затем оценили экспрессию отдельных генов IFN типа I и III с течением времени. Интересно, что хотя только IFNL1 и IFNB1 были значительно повышены в глобальном анализе (таблица S1), уровни экспрессии IFNL2 и IFNL3 (рис. 4B) также следовали той же температурной зависимости, что и ISG выделены на рис. 3C.Напротив, и в соответствии с предыдущими результатами (рис. 3A и 3E), инфекция SARS-CoV не индуцировала IFN типа I или III ни при 33 ° C, ни при 37 ° C (рис. 4B). Примечательно, что мы подтвердили экспрессию рецепторов IFN как I, так и III типа ( IFNAR1 , IFNAR2 , IFNLR1 и IL10RB ) в нескольких типах клеток неинфицированных культур hAEC с использованием scRNA-seq (S2E – S2H Фиг.) . Вместе эти результаты показывают, что инфекция SARS-CoV вызывает относительно умеренную индукцию IFN в культурах hAEC, тогда как инфекция SARS-CoV-2 приводит к более сильной индукции нескольких IFN, в которых преобладают IFN типа III и зависят от температуры.Однако вопрос о том, ограничивает ли более сильная активация врожденного иммунитета репликацию SARS-CoV-2 при 37 ° C, или же взаимодействие отдельного вируса с хозяином благоприятствует репликации SARS-CoV-2 при 33 ° C, еще предстоит определить. Тем не менее, более существенная передача сигналов врожденного иммунитета, управляемая IFN, наблюдаемая при 37 ° C, а не при 33 ° C, совпадает с более эффективной репликацией SARS-CoV-2 при 33 ° C.

Обсуждение

В текущем исследовании мы демонстрируем, что температура окружающей среды, напоминающая условия в верхних и нижних дыхательных путях, оказывает глубокое влияние как на репликацию вируса, так и на динамику вирус-хозяин, особенно врожденные иммунные ответы, во время SARS-CoV и Инфекция SARS-CoV-2 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека.Используя аутентичную модель респираторного эпителия человека in vitro, мы демонстрируем, что SARS-CoV-2, в отличие от SARS-CoV, реплицировался в 10 раз эффективнее при температурах, встречающихся в верхних дыхательных путях. Соответственно, в этих условиях было обнаружено значительно увеличенное количество клеток, положительных по нуклеокапсид-антигену. Кроме того, несмотря на внутренние вариации от донора к донору, SARS-CoV-2 и SARS-CoV были очень чувствительны к предварительной обработке экзогенными интерферонами типа I и типа III.Важно отметить, что анализ транскриптома с временным разрешением показал зависимую от температуры и вируса индукцию IFN-опосредованного противовирусного и провоспалительного ответа на инфекции SARS-CoV и SARS-CoV-2. В частности, для SARS-CoV-2 отсроченное срабатывание врожденных иммунных ответов совпало с повышенной эффективностью репликации при температурах в верхних дыхательных путях.

Одной из наиболее глубоких фенотипических характеристик молниеносного SARS-CoV-2 является ранняя репликация в верхних дыхательных путях инфицированных людей, что может способствовать высокой передаче SARS-CoV-2 [14,24,25,32].Напротив, SARS-CoV, как было показано, в первую очередь реплицируется в нижних дыхательных путях, а эффективная трансмиссивность наблюдается на более поздних стадиях клинического течения [10,12,13]. Кроме того, было показано, что SARS-CoV плохо индуцирует интерферон и провоспалительные реакции в инфицированных клетках [33,34]. Представленные здесь данные соответствуют этим характеристикам инфекций SARS-CoV и SARS-CoV-2 и способствуют пониманию разнородной динамики передачи от человека к человеку обоих зоонозных коронавирусов.Они обеспечивают основу для изучения параметров молекулярной основы обострений, вызванных инфекцией SARS-CoV-2 у предрасположенных лиц.

Учитывая, что рецептор-связывающие мотивы, взаимодействующие с человеческим рецептором ACE2 белков Spike как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2, являются высококонсервативными и что как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2 демонстрируют аналогичный клеточный тропизм, различия в 380 аминокислот, распределенные по всему геному и отличающие SARS-CoV-2 от SARS-CoV, могут объяснить специфические взаимодействия с факторами хозяина и дифференциальную эффективность репликации [2,6–9].Другой фактор, который может влиять на температурно-зависимый фенотип репликации, – это другая форма гена ORF8 в SARS-CoV Frankfurt-1. Вредное укорочение 29 нуклеотидов в ORF8 , которое связано с потерей приспособленности, было приобретено во время первоначальной передачи от человека к человеку и сохранялось в линии передачи SARS-CoV, которая лежит в основе международного распространения. SARS-CoV [35]. Следовательно, помимо сравнения репликации различных вариантов SARS-CoV ORF8 при 33 ° C и 37 ° C, было бы столь же интересно оценить фенотипическое влияние подобных усечений в гене ORF8 SARS-CoV-2, особенно после того, как было обнаружено несколько изолятов SARS-CoV-2, несущих делецию из 382 нуклеотидов, усекающую ген ORF8 [36].Такие варианты SARS-CoV-2 ORF8 можно легко сконструировать с использованием обратных генетических систем, которые недавно были созданы для SARS-CoV-2 [32,37,38].

В этом исследовании мы сообщаем о различных зависимостях от температуры эффективности репликации вирусов для SARS-CoV и SARS-CoV-2, обратно связанных с амплитудой врожденного иммунного ответа, хотя и с более выраженным фенотипом для SARS-CoV-2. Наши данные основаны на анализе дифференцированных культур эпителиальных клеток первичных дыхательных путей, полученных от нескольких доноров, которые были инфицированы SARS-CoV и SARS-CoV-2 в течение 96 часов.Существенная индукция интерфероновых и провоспалительных реакций в эпителии дыхательных путей после заражения SARS-CoV-2 при 37 ° C согласуется с другими сообщениями по множественным модельным системам, включая недифференцированные первичные клеточные системы, проанализированные между 24 и 48 hpi [39 ], альвеолосферы, полученные из стволовых клеток, при 48 hpi [40], а также недавние эксперименты по секвенированию отдельных клеток, выполненные на образцах, полученных от пациентов [41]. Дополнительное исследование, посвященное транскриптомному анализу мазков из носоглотки, полученных от пациентов, обнаружило признаки сильного противовирусного ответа и повышенную регуляцию хемокинов, которая зависела от вирусной нагрузки [42].Эти результаты были подтверждены первичными культурами из дыхательных путей; однако, по сравнению с нашим собственным анализом, этот интерфероновый ответ был отсроченным. Это различие может быть объяснено расходящейся экспериментальной установкой. В отличие от других исследований, мы напрямую сравнивали репликацию вируса и ответы хозяина при 33 ° C и 37 ° C и сообщали об отсроченной активации врожденного иммунитета и провоспалительных путей при 33 ° C. Кроме того, недавно проведенный CRISPR-скрининг всего генома показал, что для репликации SARS-CoV-2 требуются частично другие факторы хозяина при инкубации при 33 ° C или 37 ° C [43,44].

Фоксман и его коллеги изящно описали, используя модель, аналогичную культурам hAEC, и используя вирусы простуды, что на PRR-опосредованный ответ IFN влияет температура [23]. Это также может относиться к инфекциям SARS-CoV-2; однако, из-за многогранной сложной природы взаимодействий вирус-хозяин, вероятно, что эффективная репликация SARS-CoV-2 и одновременная экспрессия множества известных кодируемых коронавирусом факторов, которые противодействуют противовирусному ответу хозяина, также играют решающую роль. здесь [45–50].Тем не менее, мы демонстрируем, что SARS-CoV-2 и SARS-CoV очень чувствительны к ответам, управляемым IFN как I, так и III типа. Эти данные подтверждаются несколькими исследованиями, в которых изучались исходы предварительной обработки IFN в культивируемых клеточных линиях [39,51,52], а также хорошо задокументированная доминантная противовирусная роль IFN типа III во время вирусной инфекции в респираторном эпителии [31,53] , 54]. Таким образом, лямбда-интерферон представляет собой привлекательного кандидата для разработки стратегий вмешательства против респираторных инфекций SARS-CoV-2.

Подробная динамика репликации как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2 в культурах hAEC, а также разложенные по времени ответы хозяина на инфекцию, представленные здесь, дают решающее представление о глубоком влиянии температуры окружающей среды на основные взаимодействия вируса и хозяина в организме человека. эпителий дыхательных путей [55]. Эти данные, вероятно, будут расширены дополнительными механистическими и функциональными исследованиями in vivo, в которых будет выявлена ​​эффективность противовирусных ответов хозяина, вызванных инфекциями SARS-CoV и SARS-CoV-2, а также расшифровано влияние кодируемых вирусом антагонистов и физических параметров.Эти знания следует широко использовать для поддержки клинических приложений для борьбы с инфекциями SARS-CoV-2.

Методы

Клетки и культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека (чАЕС)

клеток Vero E6 (любезно предоставленных Дорин Мут, Марселем Мюллером и Кристианом Дростеном, Шарите, Берлин, Германия) размножали в модифицированной по Дульбекко среде Eagle-GlutaMAX с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 10% (об. / Об.) Инактивированного нагреванием фетальная бычья сыворотка (FBS), 100 мкг / мл стрептомицина, 100 МЕ / мл пенициллина, 1% (мас. / об.) заменимых аминокислот и 15 мМ HEPES (Gibco, Гейтерсбург, Мэриленд, Соединенные Штаты Америки).Клетки поддерживали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ .

Первичные трахеобронхиальные эпителиальные клетки человека были изолированы от пациентов (> 18 лет), перенесших бронхоскопию или резекцию легких в Кантональной больнице в Санкт-Галлене, Швейцария, или Инзельшпитале в Берне, Швейцария, в соответствии с этическим разрешением (EKSG 11/044, EKSG 11/103, KEK-BE 302/2015 и KEK-BE 1571/2019). Выделение и культивирование первичного материала выполняли, как описано ранее [56].Вкратце, криоконсервированные клетки оттаивали и размножали в течение 1 недели в среде BEGM. После начальной фазы размножения клетки переносили в пористые вставки, покрытые коллагеном типа IV (вставка радиусом 6,5 мм, Costar, Corning, Нью-Йорк, США), в 24-луночные планшеты. Клетки размножали еще на 2–3 дня в БЭГМ в жидко-жидком состоянии. Как только клетки достигли слияния, базолатеральную среду заменяли средой интерфейса воздух-жидкость (ALI), а апикальную среду удаляли, чтобы обеспечить создание ALI.Базолатеральную среду ALI меняли 3 раза в неделю, а апикальную сторону промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS, Gibco) один раз в неделю до развития полностью дифференцированного эпителия (3-4 недели), которое контролировали с помощью оптической микроскопии. . Были использованы несколько модификаций исходного протокола. Концентрации гидрокортизона как для BEGM, так и для ALI были увеличены до 0,48 мкг / мл, а BEGM был дополнительно дополнен ингибиторами 1 мкмоль / л A83-01 (Tocris, США), 3 мкмоль / л изопротеренола (Abcam, Кембридж, Соединенное Королевство). ) и 5 ​​мкмоль / л Y27832 (Tocris, США) [57].Базолатеральную среду ALI меняли 3 раза в неделю, а апикальную сторону промывали HBSS (Gibco) один раз в неделю. Культуры hAEC поддерживали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ .

Вирусы

SARS-CoV штамм Франкфурт-1 (GenBank FJ429166) [35,58] и SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 / München-1.1 / 2020/929) [37] были любезно предоставлены Даниэлой Нимейер, Марселем Мюллер , и Christian Drosten, и размножали и титровали на клетках Vero E6.

Заражение культур чАЕС

Хорошо дифференцированные культуры hAEC были инфицированы 30 000 бляшкообразующих единиц (БОЕ) SARS-CoV или SARS-CoV-2.Вирусы разбавляли HBSS (Gibco), инокулировали на апикальной стороне и инкубировали в течение 1 часа при 33 ° C или 37 ° C. После этого инокулят вируса удаляли и апикальную поверхность 3 раза промывали HBSS, при этом третья промывка была собрана как точка времени 1 hpi. Клетки инкубировали при указанных температурах в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ . Высвобожденное потомство вируса контролировали каждые 24 часа путем инкубации 100 мкл HBSS на апикальной поверхности за 10 минут до момента времени.Апикальные смывы собирали, разбавляли 1: 1 транспортной средой для вирусов (VTM) и хранили при -80 ° C для последующего анализа. Базолатеральную среду собирали в каждый момент времени и хранили при -80 ° C для последующего анализа. Затем в базолатеральный отсек добавляли свежую среду ALI. Для анализа репликации вируса после воздействия IFN культуры hAEC предварительно обрабатывали рекомбинантным универсальным IFN типа I (100 или 10 МЕ / мл; Sigma Aldrich, Buchs, Санкт-Галлен, Швейцария) или рекомбинантным IFN-λ3 (100 или 10 нг / мл [ 59]) в течение 18 часов с базолатеральной стороны до инфицирования и инкубировали при 33 ° C или 37 ° C.В качестве контроля использовали необработанные культуры чАЕС. Незадолго до заражения SARS-CoV и SARS-CoV-2 базолатеральную среду, содержащую IFN типа I или III, удалили и заменили средой без экзогенного IFN.

Иммунофлуоресцентный анализ инфицированных hAEC

Хорошо дифференцированные культуры чАЕС фиксировали 4% (об. / Об.) Нейтральным забуференным формалином и обрабатывали, как описано ранее [56]. Клетки были проницаемы в PBS с добавлением 50 мМ NH ₄ Cl, 0.1% (мас. / Об.) Сапонина и 2% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (CB). Для обнаружения SARS-CoV и SARS-CoV-2 культуры hAEC иммуноокрашивали кроличьими поликлональными антителами против нуклеокапсидного белка SARS-CoV (Rockland, 200-401-A50), которые также перекрестно реагируют с SARS-CoV-2. Распределение ACE2 в клетках определяли с помощью кроличьих поликлональных антител против ACE2 (ab15348, Abcam). Меченый Alexa Fluor 488 ослиный антикроличий IgG (H + L) (Jackson Immunoresearch, Кембриджшир, Великобритания) использовали в качестве вторичных антител. Меченый Alexa Fluor 647 кроличий анти-β-тубулин (9F3, Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс, США) и мышиный анти-ZO1, меченный Alexa Fluor 594 (1A12, Thermo Fisher Scientific, Дармштадт, Германия), использовали для визуализации ресничек. и плотные стыки соответственно.Антитела разводили в CB. Все образцы контрастировали с использованием 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, Thermo Fisher Scientific) для визуализации ядер. Образцы получали с помощью системы визуализации высокого разрешения DeltaVision Elite (GE Healthcare Life Sciences, Чикаго, Иллинойс, США), оснащенной масляным иммерсионным объективом 60x (1,4 NA), путем получения z-стека от 200 до 300 нм по всей толщине изображения. образец. Изображения были деконволюционированы с помощью встроенного программного обеспечения softWoRx. Для количественной оценки инфицированных клеток изображения в качестве альтернативы получали с использованием системы визуализации EVOS FL Auto 2, оснащенной воздушным объективом с 20-кратным увеличением.Все изображения обрабатывались с помощью пакетов программ FIJI [60]. Яркость и контраст были отрегулированы таким же образом, как и соответствующие элементы управления. Фигуры были собраны с помощью плагина FigureJ [61]. Количественную оценку инфицированных клеток от 4 доноров проводили путем морфологической сегментации отдельных клеток с использованием окрашивания ZO-1 и плагина MorphoLibJ в FIJI [62]. Каждую интересующую область использовали для измерения средней интенсивности в канале, соответствующем окрашиванию нуклеокапсида. Клетки со средней интенсивностью> среднего + 3 стандартных отклонения по сравнению с распределением ложно инфицированных клеток считались положительными.В среднем было проанализировано более 10 ⁴ клеток на каждого донора и на каждое состояние.

Титрование апикального и базолатерального отделов

Вирусов, высвобожденных в апикальный или базолатеральный компартменты, титровали с помощью анализа бляшек на клетках Vero E6. Вкратце, 1,7 × 10 ⁵ клеток / мл высевали в 24-луночные планшеты за 1 день до титрования и инокулировали 10-кратными серийными разведениями растворов вирусов. Инокуляты были удалены через 1,5 hpi и заменены верхней средой, состоящей из DMEM с добавлением 1.2% Авицел (RC-581, биополимер FMC), 5% термоинактивированный FBS, 50 мкг / мл стрептомицина и 50 МЕ / мл пенициллина. Клетки инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 48 часов, фиксировали 4% (об. / Об.) Нейтральным забуференным формалином и окрашивали кристаллическим фиолетовым.

Массовое штрих-кодирование и секвенирование РНК (BRB-seq) и анализ данных

Суммарную клеточную РНК из ложных и инфицированных вирусом культур hAEC экстрагировали с использованием набора NucleoMag RNA (Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland) в соответствии с инструкциями производителя по системе очистки Kingfisher Flex (Thermofisher).Концентрацию общей РНК количественно определяли с помощью системы QuantiFluor RNA (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с рекомендациями производителя для многомодового ридера Cytation 5 (Biotek, Sursee, Швейцария). Всего 100 нг общей клеточной РНК было использовано для создания библиотек BRB-seq, а последующее секвенирование на платформе Illumina HiSeq 4000 было выполнено, как описано ранее, до глубины примерно 12 миллионов необработанных считываний на образец [30]. Считывания секвенирования были демультиплексированы с помощью набора BRB-seqTools и сопоставлены с конкатенацией генома человека (hg38), генома коронавируса SARS Франкфурт-1 (AY2) и SARS-CoV-2 / Wuhan-Hu1 / 2020 ( NC_045512) с использованием выравнивателя STAR и HTSeq для получения матриц подсчета [30,63,64].После выравнивания необработанные матрицы подсчета были случайным образом субдискретизированы по всем образцам для вычисления насыщенности последовательности с использованием среднего числа считываний на образец и среднего количества обнаруженных генов (> 1 считывания) в образцах. Все последующие анализы были выполнены с использованием R (версия 3.6.1). ComBat-seq использовался с настройками по умолчанию для корректировки пакетных эффектов в необработанных данных и создания скорректированной матрицы подсчета, используемой для последующего анализа [65]. Нормализация библиотеки и различия в экспрессии между неинфицированными и зараженными вирусом образцами были количественно определены с помощью пакета DESeq2 (версия 1.28) с пороговым значением кратного изменения (FC) ≥ 1,5 и коэффициентом ложного обнаружения (FDR) ≤0,1 [66]. Из-за многофакторного дизайна этих экспериментов, анализ DE выполнялся с использованием нескольких подходов: (1) образцы были подвергнуты подмножеству температуры перед анализом DE (например, подмножество образцов для всех временных точек при 33 ° C), и инфицированные образцы были сравнены к незараженным образцам с помощью дизайна ~ Пакет + Условие; (2) образцы были разделены по температуре и времени до анализа DE (например, подмножество образцов при 33 ° C и 24 hpi), и инфицированные образцы сравнивались с неинфицированными образцами с использованием схемы ~ Партия + условие; (3) Для временного анализа все образцы хранились вместе, и идентификация значимых DE-генов с течением времени проводилась с использованием теста отношения правдоподобия (LRT) с полным дизайном ~ Условие + TH + Условие: TH (TH = конъюгация переменных температуры и времени) и сокращенный проект ~ Condition + TH.Затем была проведена иерархическая кластеризация генов на обработанной матрице подсчета с помощью стабилизирующей дисперсии трансформации (VST) идентифицированных генов DE с использованием функции degPatterns из пакета DEGreports [67]. Диаграммы Венна перекрывающихся генов DE были построены с помощью пакета VennDiagram [68]. Анализ обогащения пути был выполнен с использованием пакетов clusterProfiler и ReactomePA в R [69,70]. Значительно обогащенные пути с числом генов> 1 и значением p ≤0,05 визуализировали с помощью пакета enrichplot.Дальнейший анализ и визуализация данных выполнялись с использованием множества дополнительных пакетов в R, включая ComplexHeatmap и ggplot2 [71].

Биоинформатический анализ экспрессии ACE2 и TMPRSS2

Для анализа экспрессии мРНК ACE2 , TMPRSS2, , IFNAR1, IFNAR2, IFNRL1, и IL10RB мы повторно проанализировали ранее полученные данные секвенирования 31 отдельных клеток из неинфицированных hAEC культур. Полученная матрица подсчета уникальных идентификаторов молекул (UMI) для каждого образца была предварительно обработана и отфильтрована индивидуально, а затем образцы были объединены в Seurat (v3.1) [72]. Масштабирование данных, нормализация и регрессия нежелательных источников вариации (количество UMI, процент митохондриальных считываний, фаза клеточного цикла) были выполнены с использованием интегрированной опции SCtransform в Seurat с последующим уменьшением размеров с использованием встраивания UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). . Для аннотации типов клеток полученный интегрированный набор данных использовался для неконтролируемой кластеризации на основе графов, чтобы аннотировать различные типы клеток с использованием как кластер-специфичных маркерных генов, так и хорошо известных канонических маркерных генов, чтобы сопоставить идентифицированные кластеры с конкретными типами клеток, обнаруженными в респираторной системе. эпителий, как описано ранее [31].

Статистическое тестирование

Тестирование распределения проводилось с использованием теста нормальности Шапиро-Уилка (> 0,05), после чего вычислялось значение P среднего log10 БОЕ / мл в каждый момент времени или лечения между SARS-CoV и SARS-CoV-2 с использованием двусторонний парный образец t тест. Анализы проводились с использованием R (версия 3.6.1) или SciPy с использованием Python (версия 3.7).

Дополнительная информация

S1 Рис. Базолатеральное высвобождение SARS-CoV и SARS-CoV-2 в инфицированных культурах hAEC.

Хорошо дифференцированные культуры hAEC были инфицированы SARS-CoV и SARS-CoV-2 с использованием 30000 БОЕ или оставались неинфицированными (имитация) и инкубировались при 37 ° C ( a ) или 33 ° C ( b ). Инокулированный вирус удаляли при 1 hpi и промывали апикальную сторону. Далее культуры инкубировали при указанной температуре. В указанное время после инфицирования высвобождение вируса в базолатеральном компартменте оценивали титрованием бляшек ( a, b ). Данные представляют собой среднее значение 2 двух повторов.Данные, лежащие в основе этого рисунка, находятся в S1 Data. hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; hpi, часы после заражения; PFU, блок формирования налета; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s001

(TIF)

S2 Фиг. ACE2 экспрессируется как на реснитчатых, так и на нересничных клетках.

Иммунофлуоресцентный анализ распределения рецепторов ACE2 в неэкспонированных высокодифференцированных культурах hAEC ( a ).Неэкспонированные хорошо дифференцированные культуры hAEC фиксировали и обрабатывали для микроскопического анализа с использованием антител против ACEC2 (зеленый), β-тубулина (реснички, красный), ZO-1 (плотные контакты, белый) и DAPI (синий). Показаны репрезентативные z-проекции 3 доноров. Масштабная линейка 20 мкм. Неэкспонированные хорошо дифференцированные культуры hAEC от разных доноров-людей использовали для выполнения анализа scRNA-seq. Графики UMPA показывают размерное уменьшение 8128 клеток, принадлежащих к популяции базальных, бокаловидных, секреторных, прецилированных и реснитчатых клеток ( b ), а также относительный уровень экспрессии и распределение ACE2 ( c ) и TMPRSS2. ( d ) соответственно.Кроме того, соответствующий относительный уровень экспрессии и распределение как альфа-, так и бета-цепи рецепторов IFN-альфа / бета, IFNAR1 ( e ), IFNAR2 ( f ) и рецепторного комплекса IFN типа III IFNLR1 ( g ) и Ил-10РБ ( х ). ACE2, ангиотензин-превращающий фермент 2; hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; ИФН, интерферон; scRNA-seq, секвенирование одноклеточной РНК; UMAP, Приближение и проекция однородного многообразия.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s002

(TIF)

S3 Фиг. Графики насыщенности последовательностей библиотек BRB-seq.

Графики насыщенности последовательностей из 2 отдельных библиотек BRB-seq, охватывающих 72 ( a ) или 96 ( b ) образцов от 3 или 4 независимых биологических доноров, соответственно, иллюстрирующие среднее количество считываний (ось x) и среднее количество обнаруженных генов на библиотеку (ось Y;> 1 считывание) по образцам (слева) и общая глубина секвенирования (справа; M = миллион). BRB-seq, Массовое штрих-кодирование и секвенирование РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s003

(TIF)

S4 Рис. Процент считывания вирусов в необработанных и инфицированных вирусом культурах hAEC.

Коробчатые диаграммы, иллюстрирующие распределение доли считываний вирусов SARS-CoV ( a ) и SARS-CoV-2 ( b ) среди общей доли считываний последовательностей в различные моменты времени и температурные условия в соответствующих отдельные необработанные (имитация) образцы SARS-CoV и SARS-CoV-2 (окрашенные донором).hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s004

(TIF)

S5 Рис. Перекрытие дифференциально экспрессируемых генов в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV, и инфицированных SARS-CoV-2.

Диаграммы Венна, показывающие перекрытие DEG в культурах hAEC, инфицированных SARS-CoV или SARS-CoV-2, в разные моменты времени и температурные условия ( н.э. ) и SARS-CoV-2 в сравнении с SARS-CoV в разные момент времени и температурные условия ( e, f ).ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены; hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s005

(TIF)

S6 Рис. Тепловая карта средних уровней экспрессии временных дифференциально экспрессируемых генов.

Тепловая карта, иллюстрирующая иерархическую кластеризацию уровней экспрессии 401 уникального гена DE, идентифицированного при попарном сравнении культур hAEC, инфицированных SARS-CoV и SARS-CoV-2, по сравнению с неинфицированными культурами hAEC (Mock) в разные моменты времени и при различных температурах инкубации .Уровни экспрессии для отдельных временных DE генов показаны в строках в виде логарифма ₂ средних нормализованных значений для 7 человеческих доноров, стратифицированных по состоянию, температуре и часам после заражения (столбцы; репрезентативные цвета показаны в легендах). 29 временных генов DE, уникальных для кластера 1, показаны справа (ось y). ДЭ, дифференциально выраженная; hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s006

(TIF)

S7 Рис. Экспрессия хемокинов и цитокинов в необработанных и инфицированных вирусом культурах hAEC.

Гистограмма, показывающая средние нормализованные уровни экспрессии во времени для цитокинов IL11, IL18, IL1b и TNF ( a ) или хемокинов CCL2, CCL5, CXCL10 и CXCL11 ( b ) при соответствующих температурах. для фиктивных (неинфицированных) культур hAEC (две верхние панели) и для инфицированных SARS-CoV (две средние панели) и SARS-CoV-2 (две нижние панели) культур hAEC.Цвет столбиков был изменен, чтобы показать соответствующее SD среди доноров. hAEC, эпителиальная клетка дыхательных путей человека; SARS-CoV, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус; SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2; SD, стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001158.s007

(TIF)

Благодарности

Мы с благодарностью благодарим Федеральную политехническую школу Лозанны (EPFL) и Бернский университет за предоставление специального разрешения на проведение наших исследований во время вспышки SARS-CoV-2.Мы благодарны Сабине Березовской и Ирене Рамос-Сентено (Институт патологии Бернского университета) за предоставление тканей через Tissue Bank Bern.

Ссылки

1. 1. Ли Кью, Гуань Х, Ву П, Ван Х, Чжоу Л., Тонг И и др. Динамика ранней передачи новой пневмонии, инфицированной коронавирусом, в Ухане, Китай. N Engl J Med. 2020. pmid: 31995857
2. 2. Чжоу П., Ян X-L, Ван X-G, Ху Б., Чжан Л., Чжан В. и др. Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом, вероятно, происхождения летучих мышей.Природа. 2020; 579: 270–273. pmid: 32015507
3. 3. Coronaviridae Study Group Международного комитета по таксономии вирусов. Виды Коронавирус, связанный с тяжелым острым респираторным синдромом: классификация 2019-nCoV и присвоение ему названия SARS-CoV-2. Nat Microbiol. 2020; 1–9. pmid: 31857732
4. 4. Информационная панель ВОЗ по коронавирусной болезни (COVID-19) | Панель управления ВОЗ по коронавирусной болезни (COVID-19). [цитировано 13 января 2021 г.]. Доступно по адресу: https://covid19.who.int/.
5. 5.ВОЗ | Сводка вероятных случаев атипичной пневмонии с началом болезни с 1 ноября 2002 г. по 31 июля 2003 г. [цитировано 23 марта 2020 г.]. Доступно по адресу: https://www.who.int/csr/sars/country/table2004_04_21/en/.
6. 6. Ву А, Пэн И, Хуан Б, Дин Х, Ван Х, Ниу П и др. Состав генома и дивергенция нового коронавируса (2019-nCoV), происходящего из Китая. Клеточный микроб-хозяин. 2020; 27: 325–328. pmid: 32035028
7. 7. Ли В., Мур М.Дж., Васллиева Н., Суй Дж., Вонг С.К., Берн М.А. и др.Ангиотензин-превращающий фермент 2 является функциональным рецептором коронавируса SARS. Природа. 2003. 426: 450–454. pmid: 14647384
8. 8. Glowacka I, Bertram S, Muller MA, Allen P, Soilleux E, Pfefferle S и др. Доказательства того, что TMPRSS2 активирует тяжелый острый респираторный синдром, спайк-белок коронавируса для слияния мембран и снижает вирусный контроль за счет гуморального иммунного ответа. J Virol. 2011. 85: 4122–4134. pmid: 21325420
9. 9. Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S и др.Вхождение клеток SARS-CoV-2 зависит от ACE2 и TMPRSS2 и блокируется клинически подтвержденным ингибитором протеазы. Клетка. 2020. pmid: 32142651
10. 10. Cheng PKC, Wong DA, Tong LKL, IP SM, Lo ACT, Lau CS и др. Особенности выделения коронавируса у пациентов с вероятным тяжелым острым респираторным синдромом. Ланцет. 2004; 363: 1699–1700. pmid: 15158632
11. 11. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W и др. Коронавирус как возможная причина тяжелого острого респираторного синдрома.Ланцет. 2003; 361: 1319–1325. pmid: 12711465
12. 12. Peiris JSM, Chu CM, Cheng VCC, Chan KS, Hung IFN, Poon LLM и др. Клиническое прогрессирование и вирусная нагрузка при вспышке коронавирусной пневмонии, связанной с SARS: проспективное исследование. Ланцет. 2003; 361: 1767–1772. pmid: 12781535
13. 13. Hung IFN, Cheng VCC, Wu AKL, Tang BSF, Chan KH, Chu CM и др. Вирусные нагрузки в клинических образцах и проявления SARS. Emerg Infect Dis. 2004; 10: 1550–7. pmid: 15498155
14. 14.Вельфель Р., Корман В.М., Гуггемос В., Сейлмайер М., Занге С., Мюллер М.А. и др. Вирусологическая оценка госпитализированных пациентов с COVID-2019. Природа. 2020; 1–10. pmid: 32235945
15. 15. Zhou F, Yu T, Du R, Fan G, Liu Y, Liu Z и др. Клиническое течение и факторы риска смертности взрослых пациентов с COVID-19 в Ухане, Китай: ретроспективное когортное исследование. Ланцет. 2020; 395: 1054–1062. pmid: 32171076
16. 16. McFadden ER, Pichurko BM, Bowman HF, Ingenito E, Burns S, Dowling N, et al.Тепловое картирование дыхательных путей человека. J Appl Physiol. 1985. 58: 564–570. pmid: 3980358
17. 17. Линдеманн Дж., Лейакер Р., Реттингер Г., Кек Т. Температура слизистой оболочки носа во время дыхания. Clin Otolaryngol Allied Sci. 2002. 27: 135–139. pmid: 12071984
18. 18. Кендалл EJC, Bynoe ML, Tyrrell DAJ. Выделение вируса от простудных заболеваний в школе-интернате. Br Med J. 1962; 2: 82–86. pmid: 14455113
19. 19. Tyrrell DAJ, Bynoe ML. Культивирование нового типа вируса простуды в культурах органов.Br Med J. 1965; 1: 1467–1470. pmid: 14288084
20. 20. Хорн Б., Тиррелл DAJ. Новый вирус культивируется только в органных культурах мерцательного эпителия человека. Arch Gesamte Virusforsch. 1966; 18: 210–225. pmid: 4293705
21. 21. Корман В.М., Экерли I, Мемиш З.А., Лильяндер А.М., Дейкман Р., Джонсдоттир Х. и др. Связь повсеместного человеческого коронавируса с верблюдами-верблюдами. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2016; 113: 9864–9. pmid: 27528677
22. 22. Холверда М., Келли Дж., Лалоли Л., Штюрмер И., Портманн Дж., Сталдер Н. и др.Определение кинетики репликации и клеточного тропизма вируса гриппа D на первичных хорошо дифференцированных эпителиальных клетках дыхательных путей человека. Вирусы. 2019; 11. pmid: 31022887
23. 23. Foxman EF, Storer JA, Fitzgerald ME, Wasik BR, Hou L, Zhao H и др. Зависящая от температуры врожденная защита от вируса простуды ограничивает репликацию вируса при высокой температуре в клетках дыхательных путей мыши. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2015; 112: 827–832. pmid: 25561542
24. 24. Цзоу Л., Жуань Ф., Хуанг М., Лян Л., Хуанг Х., Хун Зи и др.Вирусная нагрузка SARS-CoV-2 в образцах верхних дыхательных путей инфицированных пациентов. N Engl J Med. 2020; 382: 1177–1179. pmid: 32074444
25. 25. He X, Lau EHY, Wu P, Deng X, Wang J, Hao X и др. Временная динамика выделения вируса и трансмиссивности COVID-19. Nat Med. 2020; 26: 672–675. pmid: 32296168
26. 26. Киндлер Э., Йонсдоттир Х.Р., Мут Д., Хэмминг О.Дж., Хартманн Р., Родригес Р. и др. Эффективная репликация нового бета-коронавируса человека EMC на первичном эпителии человека подчеркивает его зоонозный потенциал.MBio. 2013; 4. pmid: 23422412
27. 27. Dijkman R, Jebbink MF, Koekkoek SM, Deijs M, Jonsdottir HR, Molenkamp R, et al. Выделение и характеристика современных штаммов коронавируса человека в первичных культурах эпителиальных клеток человека выявили различия в тропизме клеток-мишеней. J Virol. 2013; 87: 6081–6090. pmid: 23427150
28. 28. Цзя HP, Look DC, Shi L, Hickey M, Pewe L, Netland J и др. Экспрессия рецептора ACE2 и коронавирусная инфекция тяжелого острого респираторного синдрома зависят от дифференциации эпителия дыхательных путей человека.J Virol. 2005; 79: 14614–14621. pmid: 16282461
29. 29. Бертрам С., Дейкман Р., Хабьян М., Хойрих А., Гирер С., Гловакка И. и др. TMPRSS2 активирует человеческий коронавирус 229E для катепсин-независимого проникновения клеток-хозяев и экспрессируется в вирусных клетках-мишенях в респираторном эпителии. J Virol. 2013. 87: 6150–6160. pmid: 23536651
30. 30. Alpern D, Gardeux V, Russeil J, Mangeat B, Meireles-Filho ACA, Breysse R и др. BRB-seq: сверхдоступная транскриптомика с высокой пропускной способностью, обеспечиваемая массовым штрих-кодированием и секвенированием РНК.Genome Biol. 2019; 20:71. pmid: 30999927
31. 31. Келли Дж. Н., Лалоли Л., Вковски П., Холверда М., Портманн Дж., Тиль В. и др. Комплексный анализ единичных клеток пандемического гриппа A вирусной инфекции дыхательных путей человека позволяет выявить специфические для каждого клеточного типа транскрипционные сигнатуры, имеющие отношение к прогрессированию и патогенезу заболевания. bioRxiv. 2020; 2020.04.03.014282.
32. 32. Hou YJ, Okuda K, Edwards CE, Martinez DR, Asakura T, Dinnon KH и др. SARS-CoV-2 Обратная генетика выявляет переменный градиент инфекции в дыхательных путях.Клетка. 2020; 182: 429–446.e14. pmid: 32526206
33. 33. Чаннаппанавар Р., Фер А.Р., Виджай Р., Мак М., Чжао Дж., Мейерхольц Д.К. и др. Нарушение регуляции интерферона I типа и воспалительные реакции моноцитов-макрофагов вызывают летальную пневмонию у мышей, инфицированных SARS-CoV. Клеточный микроб-хозяин. 2016; 19: 181–193. pmid: 26867177
34. 34. Гралински Л.Е., Барич Р.С. Молекулярная патология возникающих коронавирусных инфекций. J Pathol. 2015; 235: 185–195. pmid: 25270030
35. 35. Мут Д., Корман В. М., Рот Х., Бингер Т., Дейкман Р., Готтула Л. Т. и др.Ослабление репликации из-за делеции 29 нуклеотидов в коронавирусе SARS, приобретенном на ранних стадиях передачи от человека к человеку. Научный доклад 2018; 8. pmid: 2
36. 89
37. 36. Су YCF, Андерсон Д.Э., Янг Б.Э., Линстер М., Чжу Ф., Джаякумар Дж. И др. Открытие и геномная характеристика 382-нуклеотидной делеции в ORF7B и orf8 во время ранней эволюции SARS-CoV-2. MBio. 2020; 11: 1–9. pmid: 32694143
38. 37. Тхи Нху Тао Т., Лабрусса Ф., Эберт Н., Вковски П., Сталдер Х., Портманн Дж. И др.Быстрая реконструкция SARS-CoV-2 с использованием платформы синтетической геномики. Природа. 2020; 582: 561–565. pmid: 32365353
39. 38. Xie X, Muruato A, Lokugamage KG, Narayanan K, Zhang X, Zou J и др. Инфекционный клон кДНК SARS-CoV-2. Клеточный микроб-хозяин. 2020; 27: 841–848.e3. pmid: 32289263
40. 39. Blanco-Melo D, Nilsson-Payant BE, Liu WC, Uhl S, Hoagland D, Møller R и др. Несбалансированная реакция хозяина на SARS-CoV-2 способствует развитию COVID-19. Клетка. 2020; 181: 1036–1045.e9. pmid: 32416070
41. 40. Кацура Х., Сонтаке В., Тата А., Кобаяши Ю., Эдвардс К.Э., Хитон Б.Э. и др. Альвеолосферы на основе стволовых клеток легких человека дают представление об опосредованных SARS-CoV-2 интерфероновых ответах и ​​дисфункции пневмоцитов. Стволовая клетка. 2020; 27: 890–904.e8. pmid: 33128895
42. 41. Чуа Р.Л., Лукассен С., Трамп С., Хенниг Б.П., Вендиш Д., Потт Ф. и др. Тяжесть COVID-19 коррелирует с взаимодействиями эпителия дыхательных путей с иммунными клетками, выявленными с помощью одноклеточного анализа.Nat Biotechnol. 2020. pmid: 325
43. 42. Lieberman NAP, Peddu V, Xie H, Shrestha L, Huang ML, Mears MC и др. Противовирусный транскрипционный ответ хозяина in vivo на SARS-CoV-2 в зависимости от вирусной нагрузки, пола и возраста. PLoS Biol. 2020; 18. pmid: 32898168
44. 43. Schneider WM, Luna JM, Hoffmann HH, Sánchez-Rivera FJ, Leal AA, Ashbrook AW и др. Геномная идентификация сетей хост-факторов SARS-CoV-2 и пан-коронавируса. Клетка. 2021 г .; 184. pmid: 33232691
45. 44.Hoffmann HH, Sánchez-Rivera FJ, Schneider WM, Luna JM, Soto-Feliciano YM, Ashbrook AW и др. Функциональный опрос белка-хозяина SARS-CoV-2 позволяет выявить уникальные и общие факторы-хозяева коронавируса. Клеточный микроб-хозяин. 2021; 29: 267–280.e5. pmid: 33357464
46. 45. Frieman M, Yount B, Heise M, Kopecky-Bromberg SA, Palese P, Baric RS. Тяжелый острый респираторный синдром. Коронавирус ORF6 противодействует функции STAT1, изолируя ядерные импортные факторы на шероховатой эндоплазматической сетке / мембране Гольджи.J Virol. 2007. 81: 9812–9824. pmid: 17596301
47. 46. Цюст Р., Сервантес-Барраган Л., Кури Т., Блаккори Г., Вебер Ф., Людвиг Б. и др. Неструктурный белок 1 коронавируса является основным фактором патогенности: последствия для рационального дизайна вакцин против коронавируса. PLoS Pathog. 2007; 3: 1062–1072. pmid: 17696607
48. 47. Кури Т., Эрикссон К.К., Путис А., Цюст Р., Снайдер Э.Дж., Дэвидсон А.Д. и др. Домены АДФ-рибоза-1 ″ -монофосфатазы коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома и коронавируса человека 229E опосредуют резистентность к реакциям противовирусного интерферона.J Gen Virol. 2011; 92: 1899–1905. pmid: 21525212
49. 48. Züst R, Cervantes-Barragan L, Habjan M, Maier R, Neuman BW, Ziebuhr J, et al. 2’-O-метилирование рибозы обеспечивает молекулярную сигнатуру для различения собственной и чужой мРНК, зависящей от сенсора РНК Mda5. Nat Immunol. 2011; 12: 137–143. pmid: 21217758
50. 49. Киндлер Э., Гил-Круз С., Спаниер Дж., Ли Й., Вильгельм Дж., Рабоу Х. Х. и др. Раннее опосредованное эндонуклеазой уклонение от восприятия РНК обеспечивает эффективную репликацию коронавируса.PLoS Pathog. 2017; 13. pmid: 28158275
51. 50. Niemeyer D, Mösbauer K, Klein EM, Sieberg A, Mettelman RC, Mielech AM и др. Папаин-подобная протеаза определяет признак вирулентности, который варьируется среди представителей разновидностей коронавируса SARS. PLoS Pathog. 2018; 14. pmid: 30248143
52. 51. Lokugamage KG, Hage A, de Vries M, Valero-Jimenez AM, Schindewolf C, Dittmann M и др. Восприимчивость к интерферону I типа отличает SARS-CoV-2 от SARS-CoV. J Virol. 2020; 94.pmid: 32938761
53. 52. Felgenhauer U, Schoen A, Gad HH, Hartmann R, Schaubmar AR, Failing K и др. Ингибирование SARS – CoV-2 интерферонами типа I и типа III. J Biol Chem. 2020; 295: 13958–13964. pmid: 32587093
54. 53. Davidson S, McCabe TM, Crotta S, Gad HH, Hessel EM, Beinke S и др. IFN λ является сильнодействующим противогриппозным лекарственным средством без побочных воспалительных эффектов лечения IFN α. EMBO Mol Med. 2016; 8: 1099–1112. pmid: 27520969
55. 54. Galani IE, Triantafyllia V, Eleminiadou EE, Koltsida O, Stavropoulos A, Manioudaki M и др.Интерферон-λ обеспечивает неизбыточную передовую антивирусную защиту от заражения вирусом гриппа без ущерба для пригодности хозяина. Иммунитет. 2017; 46: 875–890.e6. pmid: 28514692
56. 55. Вабрет Н., Бриттон Дж. Дж., Грубер С., Хегде С., Ким Дж., Куксин М. и др. Иммунология COVID-19: современное состояние науки. Immunity Cell Press. 2020; 910–941. pmid: 32505227
57. 56. Jonsdottir HR, Dijkman R. Характеристика коронавирусов человека на хорошо дифференцированных культурах эпителиальных клеток дыхательных путей человека.Коронавирусы: методы и протоколы. Springer New York; 2015. С. 73–87. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2438-7_8 pmid: 25720473
58. 57. Гултом М., Лалоли Л., Дейкман Р. Хорошо дифференцированные первичные культуры эпителиальных клеток дыхательных путей млекопитающих. Методы молекулярной биологии. Humana Press Inc .; 2020. С. 119–134. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0900-2_10 pmid: 32833209
59. 58. Pfefferle S, Krähling V, Ditt V, Grywna K, Mühlberger E, Drosten C. Обратная генетическая характеристика естественной делеции генома в открытой рамке считывания SARS-Coronavirus штамма Франкфурт-1 7b показывает ослабляющую функцию белка 7b in vitro и in-vivo.Вирол Дж. 2009; 6: 131. pmid: 19698190
60. 59. Лаубер С., Вейрес Г., Терчинская-Дила Е., Анггакусума, Дейкман Р., Гад Х. Х. и др. Анализ транскриптома показывает классическую сигнатуру интерферона, индуцированную IFNλ4 в первичных клетках человека. Genes Immun. 2015; 16: 414–421. pmid: 26066369
61. 60. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T. и др. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Нат методы. 2012; 9: 676–682. pmid: 22743772
62. 61.Mutterer J, Zinck E. Быстрые и понятные фигурки с помощью FigureJ. J Microsc. 2013; 252: 89–91. pmid: 233
63. 62. Legland D, Arganda-Carreras I, Андрей П. MorphoLibJ: интегрированная библиотека и плагины для математической морфологии с ImageJ. Биоинформатика. 2016; btw413. pmid: 27412086
64. 63. Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренкоу Дж., Залески С., Джа С. и др. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика. 2013; 29: 15–21. pmid: 23104886
65. 64.Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq – среда Python для работы с данными высокопроизводительного секвенирования. Биоинформатика. 2015; 31: 166–169. pmid: 25260700
66. 65. Чжан Ю., Пармиджани Г., Джонсон В.Е. ComBat-seq: корректировка пакетного эффекта для данных подсчета RNA-seq. НАР Геномикс Биоинформа. 2020; 2. pmid: 33015620
67. 66. Лав М.И., Хубер В., Андерс С. Умеренная оценка кратного изменения и дисперсии данных РНК-seq с помощью DESeq2. Genome Biol. 2014; 15: 550. pmid: 25516281
68. 67.Pantano L. DEGreport: Отчет по анализу DEG. 2017.
69. 68. Чен Х, Бутрос ПК. VennDiagram: пакет для создания настраиваемых диаграмм Венна и Эйлера в R. BMC Bioinformatics. 2011; 12:35. pmid: 21269502
70. 69. Юй Г, Ван LG, Хань И, Хе Цюй. ClusterProfiler: пакет R для сравнения биологических тем среди генных кластеров. Omi A J Integr Biol. 2012; 16: 284–287. pmid: 22455463
71. 70. Yu G, He QY. ReactomePA: пакет R / Bioconductor для анализа и визуализации реактивных путей.Мол Биосист. 2016; 12: 477–479. pmid: 26661513
72. 71. Gu Z, Eils R, Schlesner M. Сложные тепловые карты выявляют закономерности и корреляции в многомерных геномных данных. Биоинформатика. 2016/05/22. 2016; 32: 2847–2849. pmid: 27207943
73. 72. Батлер А., Хоффман П., Смиберт П., Папалекси Е., Сатия Р. Объединение транскриптомных данных отдельных клеток в различных условиях, технологиях и видах. Nat Biotechnol. 2018/04/03. 2018; 36: 411–420. pmid: 29608179

Денге и тяжелая денге

Денге – вирусное заболевание, переносимое комарами, которое в последние годы быстро распространилось во всех регионах ВОЗ.Вирус денге передается самками комаров в основном вида Aedes aegypti и, в меньшей степени, Ae. albopictus . Эти комары также являются переносчиками вирусов чикунгунья, желтой лихорадки и Зика. Денге широко распространен в тропиках, с местными вариациями риска, на которые влияют осадки, температура, относительная влажность и незапланированная быстрая урбанизация.

Денге вызывает широкий спектр болезней. Это может быть как субклиническое заболевание (люди могут даже не знать, что они инфицированы), так и тяжелые симптомы гриппа у инфицированных.Хотя встречается реже, у некоторых людей развивается тяжелая форма лихорадки денге, число которой может быть любым. осложнений, связанных с сильным кровотечением, поражением органов и / или утечкой плазмы. Тяжелая денге имеет более высокий риск смерти, если не лечить ее надлежащим образом. Тяжелая форма лихорадки денге была впервые выявлена ​​в 1950-х годах во время эпидемии денге на Филиппинах. и Таиланд. Сегодня тяжелая денге поражает большинство стран Азии и Латинской Америки и стала основной причиной госпитализации и смерти среди детей и взрослых в этих регионах.

Денге вызывается вирусом семейства Flaviviridae, и существует четыре различных, но тесно связанных серотипа вируса, вызывающего денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3 и DENV-4). Считается, что выздоровление от инфекции обеспечивает пожизненный иммунитет против этот серотип. Однако перекрестный иммунитет к другим серотипам после выздоровления является лишь частичным и временным. Последующие инфекции (вторичная инфекция) другими серотипами увеличивают риск развития тяжелой денге.

Денге имеет различные эпидемиологические закономерности, связанные с четырьмя серотипами вируса. Они могут совместно циркулировать в пределах региона, и действительно, многие страны являются гиперэндемичными по всем четырем серотипам. Денге оказывает тревожное воздействие как на здоровье человека, так и на его здоровье. а также глобальная и национальная экономики. Зараженные путешественники часто переносят DENV из одного места в другое; когда в этих новых районах присутствуют восприимчивые переносчики, существует возможность установления местной передачи.

Глобальное бремя денге

Заболеваемость денге резко выросла во всем мире за последние десятилетия. Подавляющее большинство случаев протекают бессимптомно или в легкой форме и проходят самостоятельно, поэтому фактическое количество случаев денге занижено. Многие случаи также ошибочно диагностируются как другие лихорадочные болезни ^[1] .

Одна оценка моделирования указывает на 390 миллионов случаев заражения вирусом денге в год (95% вероятный интервал 284–528 миллионов), из которых 96 миллионов (67–136 миллионов) проявляются клинически (при любой степени тяжести заболевания) ^[2] .Еще одно исследование на По оценкам распространенности лихорадки денге 3,9 миллиарда человек подвергаются риску заражения вирусами денге. Несмотря на риск заражения, существующий в 129 странах ^[3] , 70% фактического бремени приходится на Азию ^[2] .

Число случаев денге, зарегистрированных в ВОЗ, увеличилось более чем в 8 раз за последние два десятилетия, с 505 430 случаев в 2000 году до более 2,4 миллиона в 2010 году и 5,2 миллиона в 2019 году. Зарегистрированные случаи смерти в период с 2000 по 2015 год увеличились с 960 к 4032.

Столь тревожный рост числа случаев частично объясняется изменением национальной практики регистрации и сообщения о денге в министерства здравоохранения и ВОЗ. Но он также представляет собой признание правительством этого бремени и, следовательно, уместности сообщить о бремени болезни денге. Таким образом, хотя полное глобальное бремя болезни является неопределенным, наблюдаемый рост только приближает нас к более точной оценке полной степени бремени.

Распространение и вспышки лихорадки денге

До 1970 года только 9 стран переживали тяжелые эпидемии денге.В настоящее время болезнь эндемична более чем в 100 странах в регионах ВОЗ в Африке, Северной и Южной Америке, Восточном Средиземноморье, Юго-Восточной Азии и Западной части Тихого океана. Америка, Юго-Восток Наиболее серьезно затронуты регионы Азии и Западной части Тихого океана, при этом на Азию приходится ~ 70% глобального бремени болезней.

По мере распространения болезни на новые регионы, включая Европу, не только увеличивается число случаев заболевания, но и происходят взрывные вспышки. Угроза возможной вспышки лихорадки денге сейчас существует в Европе; о местной передаче сообщалось впервые время во Франции и Хорватии в 2010 г., а завозные случаи были обнаружены в 3 других европейских странах.В 2012 году в результате вспышки лихорадки денге на островах Мадейра в Португалии было зарегистрировано более 2000 случаев, а завозные случаи были обнаружены на материковой части Португалии. и 10 других стран Европы. Автохтонные случаи сейчас наблюдаются почти ежегодно во многих европейских странах. Среди путешественников, возвращающихся из стран с низким и средним уровнем дохода, лихорадка денге является второй после малярии наиболее диагностируемой причиной лихорадки.

В 2020 году денге затронула несколько стран, с увеличением числа случаев заболевания в Бангладеш, Бразилии, Островах Кука, Эквадоре, Индии, Индонезии, Мальдивах, Мавритании, Майотте (Франция), Непале, Сингапуре, Шри-Ланке, Судане, Таиланде, Тиморе. -Лесте и Йемен.В 2021 г. денге продолжает поражать Бразилию, Острова Кука, Колумбию, Фиджи, Кению, Парагвай, Перу и остров Реюньон.

Пандемия COVID-19 оказывает огромное давление на системы здравоохранения и управления во всем мире. ВОЗ подчеркнула важность продолжения усилий по профилактике, выявлению и лечению трансмиссивных болезней, таких как лихорадка денге и других арбовирусных заболеваний, во время в этот критический период, поскольку число случаев заболевания в нескольких странах увеличивается, подвергая городское население наиболее высокому риску обоих заболеваний.Совместное воздействие эпидемии COVID-19 и денге может потенциально привести к разрушительным последствиям для групп риска.

Наибольшее количество случаев денге, когда-либо зарегистрированных в мире, было зарегистрировано в 2019 году. Пострадали все регионы ВОЗ, и передача денге была впервые зарегистрирована в Афганистане.

Только в Американском регионе зарегистрировано 3,1 миллиона случаев, из которых более 25 000 классифицированы как тяжелые. Несмотря на это тревожное количество случаев, смертей от денге было меньше, чем в предыдущем году.

Большое количество случаев было зарегистрировано в Бангладеш (101 000), Малайзии (131 000), Филиппинах (420 000), Вьетнаме (320 000) в Азии.

2016 год также характеризовался крупными вспышками денге: в Американском регионе было зарегистрировано более 2,38 миллиона случаев. В течение этого года только в Бразилии было зарегистрировано около 1,5 миллиона случаев заболевания, что примерно в три раза больше, чем в США. 2014; Также в регионе зарегистрировано 1032 случая смерти от денге.В том же году в Регионе Западной части Тихого океана было зарегистрировано более 375 000 подозреваемых случаев, из которых Филиппины сообщили о 176 411 и Малайзия 100 028 случаев, что составляет аналогичное бремя. к предыдущему году для обеих стран. На Соломоновых островах объявлена ​​вспышка, подозреваемая более 7000 человек. В Африканском регионе Буркина-Фасо сообщила о локальной вспышке денге с 1061 вероятным случаем.

В 2017 году было зарегистрировано значительное сокращение в Северной и Южной Америке – с 2 177 171 случая в 2016 году до 584 263 случаев в 2017 году.Это представляет собой сокращение на 73%. Панама, Перу и Аруба были единственными странами, в которых зарегистрировано увеличение случаев заболевания в течение 2017 года.

Аналогичным образом, в течение 2017 года также было зарегистрировано 53% -ное сокращение случаев тяжелой денге. В период после вспышки вируса Зика (после 2016 года) число случаев денге снизилось, и точные факторы, приведшие к этому падению, до сих пор неизвестны.

Передача

Передача от комаров человеку

Вирус передается людям через укусы инфицированных самок комаров, в первую очередь комара Aedes aegypti .Другие виды рода Aedes также могут действовать как переносчики, но их вклад является вторичным по отношению к Aedes aegypti .

После кормления человека, инфицированного DENV, вирус реплицируется в средней кишке комара, а затем распространяется на вторичные ткани, включая слюнные железы. Время, необходимое для передачи вируса на новый хост, называется внешний инкубационный период (EIP). EIP занимает около 8-12 дней при температуре окружающей среды 25-28 ° C ^[4-6] .На изменения внешнего инкубационного периода влияет не только температура окружающей среды; ряд факторов такие как величина суточных колебаний температуры ^{[7, 8]} , генотип вируса ^[9] и начальная вирусная концентрация ^[10] также могут изменить время, необходимое комару для передачи вируса. Когда-то заразный комар способен передавать вирус всю оставшуюся жизнь.

Передача от человека к комару

Комары могут заразиться от людей, инфицированных вирусом DENV.Это может быть кто-то, у кого симптоматическая инфекция денге, кто-то, у кого еще не было симптоматической инфекции (они предсимптоматичны), но также люди, у которых нет никаких признаков болезни. а также (они бессимптомны) ^[11] .

Передача от человека к комару может произойти за 2 дня до того, как у кого-то проявятся симптомы болезни ^{[5, 11]} , до 2 дней после исчезновения лихорадки ^[12] .

Риск заражения комарами положительно связан с высокой виремией и высокой температурой у пациента; и наоборот, высокие уровни DENV-специфических антител связаны со снижением риска заражения комарами (Nguyen et al.2013 PNAS). Большинство людей виремия длится около 4-5 дней, но может длиться до 12 дней ^[13] .

Другие способы передачи

Первичный способ передачи DENV между людьми связан с комарами-переносчиками. Однако есть данные о возможности передачи инфекции от матери (от беременной матери ее ребенку). Хотя показатели вертикальной передачи кажутся низкими, с риском вертикальной передачи, по-видимому, связанной со сроком инфицирования денге во время беременности ^[14-17] .Когда у матери действительно есть инфекция DENV во время беременности, младенцы могут страдать от преждевременных родов, низкой массы тела при рождении и развития плода. бедствие ^[18] .

Vector Ecology

Комар Aedes aegypti считается основным переносчиком DENV. Он обитает в городских условиях и размножается в основном в искусственных контейнерах. Ae. aegypti – дневная кормушка; пиковые периоды укусов – рано утром и вечером до заката ^[19] Самка Ae.aegypti часто кормят несколько раз между каждым периодом яйцекладки ^[20] . После того, как самка отложила яйца, эти яйца могут оставаться жизнеспособными в течение нескольких месяцев и из них вылупятся при контакте. с водой.

Aedes albopictus , вторичный переносчик лихорадки денге в Азии, распространился на более чем 32 штата США и более 25 стран Европейского региона, в основном благодаря международной торговле использованными шинами (среда обитания) и другие товары (например,г. счастливый бамбук). Ae. albopictus очень адаптивен. Его географическое распространение во многом связано с его переносимостью более холодных условий, как яйца и взрослые особи ^{[21, 22]} . Aedes albopictus был задействован как первичный вектор DENV в ограниченном количестве вспышек, где Aedes aegypt i либо отсутствует, либо присутствует в небольшом количестве ^{[23, 24]}

Характеристики заболевания (признаки и симптомы)

Денге – тяжелая форма, гриппоподобное заболевание, поражающее младенцев, детей младшего возраста и взрослых, но редко приводящее к смерти.Симптомы обычно сохраняются в течение 2–7 дней после инкубационного периода в течение 4–10 дней после укуса инфицированного комара ^[25] . Всемирная организация здравоохранения классифицирует денге на 2 основные категории: денге (с / без предупреждающих знаков) и тяжелая денге. Подклассификация лихорадки денге с предупреждающими признаками или без них предназначена для помощи практикующим врачам в сортировке пациентов. для госпитализации, обеспечивая тщательное наблюдение и сводя к минимуму риск развития более тяжелой формы денге (см. ниже).

Денге

Денге следует подозревать, когда высокая температура (40 ° C / 104 ° F) сопровождается 2 из следующих симптомов во время лихорадочной фазы:

• сильная головная боль
• боль за глазами
• мышечная и боли в суставах
• тошнота
• рвота
• опухшие железы
• сыпь.

Тяжелая форма лихорадки денге

Пациент обычно входит в так называемую критическую фазу примерно через 3–7 дней после начала заболевания.Именно в это время, когда у пациента падает температура (ниже 38 ° C / 100 ° F), могут проявляться предупреждающие признаки, связанные с тяжелой формой лихорадки денге. Тяжелый Денге является потенциально смертельным осложнением из-за утечки плазмы, скопления жидкости, респираторной недостаточности, сильного кровотечения или поражения органов.

Предупреждающие знаки, на которые должны обратить внимание врачи:

• сильная боль в животе
• постоянная рвота
• учащенное дыхание
• кровоточивость десен
• усталость
• беспокойство
• кровь в рвоте.

Если у пациентов проявляются эти симптомы во время критической фазы, необходимо тщательное наблюдение в течение следующих 24–48 часов, чтобы можно было оказать надлежащую медицинскую помощь, чтобы избежать осложнений и риска смерти.

Диагностика

Для диагностики инфекции DENV можно использовать несколько методов. К ним относятся вирусологические тесты (которые непосредственно обнаруживают элементы вируса) и серологические тесты, которые обнаруживают иммунные компоненты человеческого происхождения, которые вырабатываются в ответ на вирус).В зависимости от времени обращения к пациенту использование различных диагностических методов может быть более или менее целесообразным. Образцы, взятые у пациентов в течение первой недели болезни, должны быть проверены как серологическими, так и вирусологическими методами. (ОТ-ПЦР).

Вирусологические методы

Вирус можно выделить из крови в течение первых нескольких дней заражения. Доступны различные методы обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). В целом, анализы ОТ-ПЦР чувствительны, но они требуют специальных оборудование и техническое обучение персонала, проводящего тестирование, поэтому они не всегда доступны во всех медицинских учреждениях.Продукты ОТ – ПЦР из клинических образцов также могут использоваться для генотипирования вируса, что позволяет проводить сравнения с образцы вирусов из различных географических источников.

Вирус также может быть обнаружен путем тестирования на продуцируемый вирусом белок, называемый NS1. Для этого доступны коммерчески выпускаемые экспресс-диагностические тесты, поскольку для определения результата требуется всего ~ 20 минут, и для этого теста не требуется специализированный тест. лабораторные методы или оборудование.

Серологические методы

Серологические методы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), могут подтвердить наличие недавней или прошлой инфекции с обнаружением антител IgM и IgG к денге.Антитела IgM обнаруживаются примерно через 1 неделю после заражения и являются самыми высокими. через 2-4 недели после начала болезни. Они остаются обнаруживаемыми около 3 месяцев. Присутствие IgM указывает на недавнюю инфекцию DENV. Уровни антител IgG развиваются дольше, чем уровни IgM, но IgG остаются в организме годами. Присутствие IgG указывает на перенесенную инфекцию.

Лечение

Специального лечения лихорадки денге не существует.

Снижающие температуру и обезболивающие можно принимать для контроля симптомов мышечных болей и болей, а также лихорадки.

• Лучшими вариантами лечения этих симптомов являются парацетамол или парацетамол.
• Следует избегать НПВП (нестероидных противовоспалительных средств), таких как ибупрофен и аспирин. Эти противовоспалительные препараты разжижают кровь, а при заболевании с риском кровотечения препараты для разжижения крови могут ухудшить прогноз.

При тяжелой форме лихорадки денге медицинская помощь врачей и медсестер, столкнувшихся с последствиями и прогрессированием заболевания, может спасти жизни, снизив уровень смертности с более чем 20% до менее 1%.Поддержание объема жидкости в организме пациента критически важны для лечения тяжелой денге. Пациентам с лихорадкой денге следует обратиться за медицинской помощью при появлении предупреждающих знаков.

Вакцинация против денге

Первая вакцина против денге, Dengvaxia® (CYD-TDV), разработанная Санофи Пастер, была лицензирована в декабре 2015 года и теперь одобрена регулирующими органами примерно в 20 странах. В ноябре 2017 года результаты дополнительного анализа ретроспективно определить серостатус на момент вакцинации.Анализ показал, что подмножество участников испытания, которые были признаны серонегативными во время первой вакцинации, имели более высокий риск более тяжелой формы лихорадки денге и госпитализаций. от денге по сравнению с невакцинированными участниками. Таким образом, вакцина предназначена для людей, живущих в эндемичных районах, в возрасте от 9 до 45 лет, которые ранее перенесли как минимум 1 задокументированную инфекцию вирусом денге.

Позиция ВОЗ в отношении вакцины CYD-TDV

Как описано в документе с изложением позиции ВОЗ в отношении вакцины Dengvaxia (сентябрь 2018 г.), живая аттенуированная вакцина против денге CYD-TDV была показана в клинических испытаниях как эффективная и безопасная для людей, которые перенесла инфекцию вирусом денге в прошлом (серопозитивная лиц).Однако он несет в себе повышенный риск тяжелой формы лихорадки денге у тех, кто впервые испытал естественную инфекцию денге после вакцинации (те, кто был серонегативен на момент вакцинации). Для стран, рассматривающих вакцинацию как В рамках их программы борьбы с лихорадкой денге рекомендуется проводить предварительный скрининг. При такой стратегии вакцинации будут проводиться только лица с признаками перенесенной инфекции денге (на основе теста на антитела или лабораторных данных). подтвержденная инфекция денге в прошлом).Решения о внедрении стратегии предвакцинального скрининга потребуют тщательной оценки на уровне страны, включая рассмотрение чувствительности и специфичности имеющихся тестов и местных тестов. приоритеты, эпидемиология денге, частота госпитализаций по денге в конкретных странах и доступность как CYD-TDV, так и скрининговых тестов.

Вакцинацию следует рассматривать как часть комплексной стратегии профилактики денге и борьбы с ней. Существует постоянная необходимость придерживаться других мер профилактики болезней, таких как хорошо проводимая и устойчивая борьба с переносчиками болезней.Лица, вакцинированные или нет, следует немедленно обратиться за медицинской помощью при появлении симптомов, подобных денге.

Профилактика и борьба

Если вы знаете, что у вас лихорадка денге, избегайте новых укусов комаров в течение первой недели болезни. В это время в крови может циркулировать вирус, и поэтому вы можете передать вирус новым неинфицированным комарам, которые, в свою очередь, могут заразить других. люди.

Близость мест размножения комаров-переносчиков комаров к жилью людей является значительным фактором риска денге, а также других болезней, переносимых комарами Aedes .В настоящее время основным методом контроля или предотвращения передачи лихорадки денге вирус предназначен для борьбы с комарами-переносчиками. Это достигается за счет:

• Предотвращение размножения комаров:
• Предотвращение попадания комаров в места откладывания яиц за счет управления и модификации окружающей среды;
• Правильное удаление твердых отходов и удаление искусственных искусственных сред обитания, способных удерживать воду;
• Еженедельное укрытие, опорожнение и очистка емкостей для хранения бытовой воды;
• Нанесение соответствующих инсектицидов на наружные контейнеры для хранения воды;

• Индивидуальная защита от укусов комаров:
• Использование индивидуальных бытовых средств защиты, таких как оконные сетки, репелленты, обработанные инсектицидами материалы, змеевики и испарители.Эти меры необходимо соблюдать в течение дня как внутри, так и вне дома (например: на работе / в школе). потому что основные комары-переносчики кусаются в течение дня;
• Рекомендуется носить одежду, которая сводит к минимуму воздействие комаров на кожу;

• Участие сообщества:
• Информирование населения о рисках болезней, передаваемых комарами;
• Взаимодействие с местным сообществом с целью расширения участия и мобилизации для устойчивой борьбы с переносчиками болезней;

• Реактивная борьба с переносчиками болезней:
• Чрезвычайные меры борьбы с переносчиками, такие как применение инсектицидов в виде космического опрыскивания во время вспышек, могут использоваться органами здравоохранения;

• Активный надзор за комарами и вирусами:
• Для определения эффективности контрольных вмешательств необходимо проводить активный мониторинг и наблюдение за численностью переносчиков и видовым составом;
• Перспективный мониторинг распространенности вируса в популяции комаров с активным скринингом дозорных коллекций комаров;

Кроме того, среди многих групп международных сотрудников продолжаются исследования в поисках новых инструментов и инновационных стратегий, которые будут способствовать глобальным усилиям по прекращению передачи денге, а также других болезней, переносимых комарами.ВОЗ поощряет интеграцию подходов к борьбе с переносчиками для достижения устойчивых и эффективных мероприятий по борьбе с переносчиками, адаптированных к местным условиям.

Ответные меры ВОЗ

ВОЗ реагирует на лихорадку денге следующим образом:

• поддерживает страны в подтверждении вспышек болезни через свою сеть лабораторий;

• предоставляет странам техническую поддержку и рекомендации по эффективному ведению вспышек денге;

• поддерживает страны в улучшении их систем отчетности и отражении истинного бремени болезни;

• обеспечивает обучение по клиническому ведению, диагностике и борьбе с переносчиками болезней на национальном и региональном уровне с некоторыми из своих сотрудничающих центров;

• формулирует основанные на фактах стратегии и политику;

• оказывать поддержку странам в разработке стратегий профилактики денге и борьбы с ней, а также в принятии Глобальных ответных мер по борьбе с переносчиками (2017-2030).

• рассматривает разработку новых инструментов, включая инсектицидные продукты и технологии нанесения;

• собирает официальные отчеты о денге и тяжелой денге из более чем 100 государств-членов; и

• издает руководства и справочники по эпиднадзору, ведению больных, диагностике, профилактике лихорадки денге и борьбе с ней для государств-членов.

Цитированные ссылки

[1] Wagoner, J.J., et al., Виремия и клиническая картина у инфицированных никарагуанских пациентов Wi1. Вагонер, Дж. Дж. И др., Виремия и клинические проявления у никарагуанских пациентов, инфицированных вирусом Зика, вирусом чикунгунья и вирусом денге. Клинические инфекционные болезни, 2016. 63 (12): с. 1584-1590.

[2] Бхатт, С. и др., Глобальное распространение и бремя денге. Природа, 2013. 496 (7446): с. 504–507.

[3] Брэди, О.J., et al., Уточнение глобальных пространственных ограничений передачи вируса денге на основе консенсуса, основанного на фактических данных. PLOS «Забытые тропические болезни», 2012. 6 (8): p. e1760.

[4] Тьаден, Н.Б. и др., Внешний инкубационный период лихорадки денге: знания, отставание и применение температурной зависимости. Плос, забытые тропические болезни, 2013. 7 (6): p. 5.

[5] Силер, Дж. Ф., М. В. Холл, А. П. Хитченс, Денге: история болезни, эпидемиология, механизм передачи, этиология, клинические проявления, иммунитет и профилактика.1926, Манила: Бюро науки.

[6] Уоттс, Д.М. и др., Влияние температуры на эффективность вектора Aedes aegypti в отношении вируса Денге 2. Американский журнал тропической медицины и гигиены, 1987. 36 (1): p. 143-152.

[7] Каррингтон, Л. Б. и др., Колебания при низких средних температурах ускоряют передачу вируса денге Aedes aegypti. PLOS «Забытые тропические болезни», 2013. 7 (4): p. e2190.

[8] Ламбрехтс, Л.и др. Влияние суточных колебаний температуры на передачу вируса денге Aedes aegypti. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки, 2011. 108 (18): п. 7460-7465.

[9] Андерсон, Дж. Р. и Р. Рико-Гессе, Aedes aegypti, векторная способность определяется генотипом инфицирования вируса денге. Американский журнал тропической медицины и гигиены, 2006. 75 (5): p. 886-892.

[10] Е.Ю.X.H. и др., Wolbachia снижает потенциал передачи вируса денге Aedes aegypti. PLOS «Забытые тропические болезни», 2015. 9 (6): p. e0003894.

[11] Дуонг В. и др. Бессимптомные люди передают вирус денге комарам. Труды Национальной академии наук США, 2015. 112 (47): с. 14688–14693.

[12] Нгуен Н.М. и др. Хозяева и вирусные особенности случаев лихорадки денге у человека формируют популяцию инфицированных и заразных комаров Aedes aegypti.Труды Национальной академии наук США of America, 2013. 110 (22): с. 9072-9077.

[13] Гублер Д.Дж. и др., Виремия у пациентов с естественной инфекцией денге. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения, 1981. 59: с. 623-630.

[14] Басурко С. и др., Оценка риска вертикальной передачи денге: перспективное исследование. Американский журнал тропической медицины и гигиены, 2018.98 (6): с. 1826-1832 гг.

[15] Мазарин, Н., Дж. М. Розенталь и Дж. Девендж, Передача денге матери младенцу во время эпидемии денге 2009–2010 гг .: наблюдение за четырьмя случаями. Archives De Pediatrie, 20141. Wagoner, J.J., et al., Viremia. и клиническая картина у никарагуанских пациентов, инфицированных вирусом Зика, вирусом чикунгунья и вирусом денге. Клинические инфекционные болезни, 2016. 63 (12): с. 1584-1590.

[16] Синхабаху, В.П., Р. Сатанантан и Г. Малевич, перинатальный передача денге: отчет о случае. BMC Research Notes, 2014. 7 (795).

[17] Басурко, г. C., et al., Материнский и плодный последствия лихорадки денге при беременности. Европейский журнал Акушерство, гинекология и репродуктивная биология, 2009. 147 (1): с. 29-32.

[18] Пулио, S.H. и др., Денге по материнской линии и Систематический обзор результатов беременности.Акушерство и гинекология Обзор, 2010. 65 (2): с. 107-118.

[19] Трпис, М. и др., ДИЕЛЬ ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПОСАДКИ АЕДЕС-АЕГИПТИ НА ЧЕЛОВЕК. Бюллетень Всемирной организации здравоохранения, 1973. 48 (5): p. 623-629.

[20] Скотт, T.W. и др., Продольные исследования Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) в Таиланде и Пуэрто-Рико: кормление кровью частота. Журнал медицинской энтомологии, 2000.37 (1): с. 89-101.

[21] Медлок, J.M. и др., Анализ потенциала для выживания и сезонной активности Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) в Объединенное королевство. Журнал векторной экологии, 2006. 31 (2): с. 292-304.

[22] Роми, Р., Северини Ф., Тома Л.