Пропись цифра 5: Прописи цифра 5 распечатать для детей бесплатно

Цифра 5 и число 5. Обучение счету дошкольников.

<<< Обучение математике

<<< Учим цифры и числа от 0 до 10

Цифра 5 или, как ее еще называют, пятерка, совсем не простая для написания. На что похожа цифра 5? Скорей всего, на крючочек. Тебе надо найти все пятерки на наших бланках. Найди и обведи их кружком. Теперь будем учиться писать пятерку, только без спешки. Цифру 5 можно написать с помощью двух прямых линий и разомкнутого круга. Ты уже научился писать тройку, теперь сможещь написать и пятерку. Пятерка очень хорошая цифра. Если ты будешь отлично учиться в школе, тебе будут ставить только пятерки. Пособие поможет запомнить, какое число обозначается пятеркой – это пять предметов: пять карандашей, пять стаканов, пять штанов. Пять поросят можно также обозначить цифрой 5, и пятерых обезьянок сосчитать: раз, два, три, четыре, пять и написать пятерку. Всему, что в пяти экземплярах, соответствует число пять, а записывается это число с помощью цифры 5.

Скачайте бланки для изучения цифры 5: скачать бланки с цифрой 5

Для изучения остальных цифр и чисел перейдите по ссылкам:

ВНИМАНИЕ! Все бланки подготовлены в формате pdf. Как правило, на большинстве компьютеров уже установлена бесплатная программа Adobe Reader, с помощью которой вы сможете открыть и распечатать карточки. Если по какой-либо причине у вас нет этой программы, или возникают проблемы при открытии бланков, обратитесь за новейшей версией программы на сайт фирмы ADOBE по ссылке скачать Adobe Reader

   

   

   

Математические игры

Занимательная математика для дошкольников

Обучение счету

Учимся считать

Занимательная геометрия

Видео – Букварь на YouTube

Новейший онлайн букварь

Математика для дошкольников

Логические игры

   

Учимся писать цифры 5 лет. Прописи для детей — буквы, цифры, игры

Знакомя ребенка с математикой в дошкольном возрасте, родители стараются привить любовь к этой науке. Прописи цифры помогут малышу научиться писать числа красиво и правильно. Написать цифры прописью вовсе не так легко. На освоение этого навыка в школе у непоседливого первоклассника часто не хватает времени и сил, поэтому к пятому классу его тетради по математике выглядят весьма печально. Как научить ребенка писать цифры, занимаясь с ним дома, чтобы занятия были в радость и на пользу?

Из этой статьи вы узнаете

Когда начинать

В каком возрасте лучше учить ребенка писать цифры прописью зависит не только от желания родителей. Многие хотят пораньше обучить своего малыша, как правильно писать цифры. Но если у ребенка еще неразвита мелкая моторика рук, он не умеет считать, и заниматься ему не очень хочется, покупать прописи с цифрами еще рано. Опытные педагоги не советуют предлагать прописи цифры для детей в три–четыре года по нескольким причинам:

• формируются неправильные навыки письма, так как ребенок еще не способен оценить прием написания чисел;
• у ребенка пропадает интерес осваивать новый материал в школе, если учитель объясняет то, что ему давно знакомо и успело надоесть;
• ребенок должен получить начальную подготовительную базу, которая включает умение держать ручку, ровно сидеть за партой, быть аккуратным и внимательным;

Когда малыш сам выявит желание заниматься, заполняя пропись цифр, можно скачивать материал для обучения из интернета бесплатно. Скачать прописи для дошкольников и распечатать можно самые разные: с картинками раскрасками, с узорами из различных элементов, образец, который нужно обводить по точкам. Первые занятия должны проходить в игровой форме и не утомлять ребенка.

Упражнения для развития мелкой моторики

Распечатанный цифровой образец, который нужно обвести, является хорошим упражнением для развития мелкой моторики. Но в два или три года давать ребенку прописи еще рано. Начинать нужно с простых занятий аппликацией, лепкой из пластилина или соленого теста.

Можно делать самостоятельно или покупать в игрушечных магазинах сенсорные коробки с сыпучими материалами, фигурками зверей из пластика или резины, камешками разной формы и размера. Построение из элементов игры различных сценок будет способствовать развитию мелкой моторики рук ребенка с одного года.

С малышом старшего возраста можно заниматься нанизыванием бус на ниточку. В качестве бус могут служить большие пуговицы, крышечки от пластиковых бутылок, деревянные катушки из-под ниток.

Нужно делать с малышом пальчиковую гимнастику, рассказывая забавные стишки про сороку-ворону, которая кашу варила и деток кормила, про зайчиков и белочек, про мальчиков и девочек.

Можно устраивать театр теней при помощи рук, складывать оригами, плести макраме, делать фигурки и браслеты из резинок, вырезать новогодние снежинки, плести фигурки из крупного бисера. Собирание мелкого конструктора тоже прекрасно развивает мелкую моторику пальчиков, но старайтесь не давать мелкие детали деткам до трех лет, чтобы они их случайно не проглотили.

Важно научить ребенка правильно держать карандаш и ручку. Чтобы карандаш лежал на среднем пальце руки, будучи зажат большим и указательным пальцами, потренироваться придется долго. Не ругайте малыша, если он держит карандаш неправильно, раскрашивая картинки. Объясните, что если он хочет научиться рисовать и писать, карандаш нужно держать, так как это делает мама или папа. Хвалите ребенка за старание и малейшие успехи, стараясь не замечать промахов и ошибок.

Как проводить занятия

Учимся писать цифры играя. Урок письма должен стать не сухим заучиванием правил написания по клеточкам, а творческим занятием, развивающим воображение. Желательно, чтобы ребенок понимал то, что он пишет. Учить значение чисел можно с двух лет.

В пять лет можно начинать учить, как пишутся числа в прописях. Сначала необходимо объяснить ребенку, из каких частей состоит клетка в тетради. Где у нее верхняя сторона, где нижняя, правая и левая. Малыш должен сам находить центр клетки. Правильное написание цифр – это мамина гордость. Но нельзя торопить малыша.

Навык письма формируется по наблюдениям психологов в течение нескольких лет жизни. Привычка выполнять задание торопливо и небрежно, чтобы быстрее окончить урок и заняться более интересными делами – это нежелательное поведение, которое нужно сразу корректировать. Вносить в дошкольный период обучения элемент игры можно самыми разными способами.

Заполнение прописи

Заполняя с ребенком прописи пишем цифры правильно, чтобы в школе не пришлось переучиваться. Правила написания по клеточкам от 1 до 10 показывают малышу в виде небольших карточек со стрелками, так он лучше поймет движение ручки во время письма и запомнит.

Вариант для цифры 1

Письмо цифры 1 начинается почти от середины клетки. Рисуют короткую палочку до угла клеточки. Потом вниз из правого угла длинную палочку, которая опускается на сторону основание клеточки.

Вариант для цифры 2

Писать цифру 2 начинают выше центра клеточки. Рисуют плавный полукруг, который касается середины правой части верха клеточки и середины верхней части правой стороны клеточки. Плавно закругляясь в виде ровной палочки, полукруг числа два опускается на черту-основание клетки немного левее середины. Теперь рисуют хвостик, который красивой волной упирается в правую сторону клеточки недалеко от основания. На этом письмо цифры 2 окончено.

Вариант для цифры 3

Число три состоит из двух полуокружностей. Начинают писать из точки, которая находится немного ниже середины верхней грани клеточки. Закругляя, ведут полуовал, который соприкасается с верхней гранью и с правой, ближе к углу. Оканчивается верхний полуовал чуть выше и правее центра клетки. За ним рисуют второй полуовал, который опирается одним боком на правую сторону клеточки и, доходя до основания, оканчивается чуть левее его середины.

Вариант для цифры 4

Число четыре так же как один, не имеет симпатичных округлостей и плавных линий. Она состоит из прямых линий и углов. Письмо цифры 4 начинают из точки, лежащей на середине правой части верхней грани. Ведут линию до точки, которая находится немного ниже центра клеточки. Рисуют угол, со стороной параллельной основанию. Останавливаются, не доходя до правой стороны. Из точки, лежащей немного выше середины правой стороны, рисуют под наклоном линию до основания клеточки.

Вариант для цифры 5

У числа пять рисуют ровную палочку вниз, по направлению к центру, из точки немного правее середины верхней грани клеточки. Красивый полукруг, отходящий от палочки, соприкасается с правой стороной клеточки посредине и опускается на сторону основание клетки. В конце из начальной точки рисуют хвостик в виде полукруга, который упирается в угол клеточки.

Вариант для цифры 6

Число шесть похоже на девять, которое поставили на голову. Начинают писать шестерку из точки на правой стороне клеточки, недалеко от верхнего угла. Ведут полукруглый хвостик до нижней стороны клеточки. Против часовой стрелки рисуют овал, который занимает чуть больше одной четвертой части пространства.

Вариант для цифры 7

Число семь пишут почти так же, как один. Только начинают вести не ровную линию, а плавную, как волну, из точки немного ниже середины верхней грани клеточки. Потом из правого угла клетки рисуют ровную ножку до основания, немного правее середины. Перечеркивают ножку цифры посередине короткой ровной чертой слева направо.

Вариант для цифры 8

Писать цифру 8 проще простого. Рисуют полукруг, как для числа два, начиная вести из точки немного выше центра клетки. На основании закругляют линию и рисуют второй полукруг больше, возвращая ручку в первоначальную точку написания числа восемь.

Вариант для цифры 9

Писать цифру 9 нужно из точки, которая находится в середине верхней части правой стороны клетки. Нарисовав небольшой овал, который почти помещается в одной четвертой части клетки, возвращаются в первоначальную точку и рисуют полукруглую ножку у овала. Ножка овала, доходя до середины основания клетки, закругляется немного вверх.

Вариант для цифры 0

Ноль, похожий на круглый бублик, начинают рисовать из точки, которая лежит на верхней грани клетки, недалеко от правого угла. Движение идет против часовой стрелки, через центр клетки, опускается на ее основание посередине и возвращается в исходную точку, соприкасаясь с правой стороной клетки вверху.

Освоив, как красиво писать первый десяток чисел, не забывайте повторять с ребенком простые правила сложения и вычитания. Тогда красиво написанные числа в тетради по математике для 1 класса будут стоять в правильно решенных задачках.

Прописи – специальные альбомы и пособия для тренировки правильного написания букв и подготовки руки дошкольника к письму. Если раньше мы, родители, знали прописи только в школе (это были тетрадки, в которых первоклассники учились аккуратно писать буквы), то сейчас можно найти специальные прописи для малышей и дошкольников. Прописи для детей: фигуры, цифры, буквы учат малышей красиво писать и тренируют руку.

Есть прописи которые предназначены для определенного возраста ребенка. На прилавках магазинов вы можете найти прописи для детей 3-4 или 5-6 лет.

В этой статье я подготовила для вас комплекты прописей которые можно бесплатно скачать и самостоятельно распечатать. Вы можете сохранить нужные картинки и давать ребенку каждый день новый листок с прописями.

Прописи для малышей

Вы думаете, что прописи только для подготовки к школе? Это не совсем так. Маленькие дети могут обводить по контуру или пунктиру простые картинки или большие буквы. Это прописи для малышей. В таких прописях почти нет текста, ведь ребенок еще не может читать. Зато они очень крупные, а картинки забавные. Почему бы не предложить малышу обвести веселого петушка по точкам или раскрасить утенка.

Деткам 4-5 лет можно предложить поиграть с – это тоже своеобразные прописи. В таких прописях вы не найдете цифр или букв, они для малыша еще сложны. Но задания на логику или точность движений будут обязательно. Выполняя обводку фигур, проводя кривые и ровные линии ребенок осваивает ручку или карандаш, учится нажиму и рисованию без отрыва от бумаги.

Среди прописей для малышей можно выделить особую группу прописей – это штриховки . Они представляют собой рисунки, которые нужно заполнять ровными или пунктирными линиями, в зависимости от задания.

Прописи для детей 5-6 лет

Для детей 5-6 лет прописи будут с более сложными заданиями. В них включены печатные и письменные буквы, а также палочки, крючки и другие части из которых строятся письменные буквы. Но пунктирные линии в этих прописях сохраняются. По ним ребенок обводит буквы, учится вести линию ровно и без отрыва. Лучше обводить буквы в прописях хорошей ручкой, потому что работая карандашом, ребенок может слишком сильно нажимать на карандаш, а от этого будет уставать рука.

Используя такие прописи ребенок не только познакомится с буквами русского алфавита, но и станет лучше их запоминать, а также выучит как они пишутся письменно. Также в прописях для дошкольников часто встречаются цифры. Дошкольник знакомится с цифрами и счетом.

Прописи для детей 5-6 лет можно условно разделить на:

• прописи АЛФАВИТ,
• прописи ЦИФРЫ.

Прописи для школьников

Чтобы ребенок научился красиво писать, а почерк у него сохранялся и не портился, нужно много заниматься. В школе учителя не придают большого значения правильной постановке руки во время письма и почерку. Но родители могут сами попробовать позаниматься с ребенком с помощью специальных прописей для школьников.

Каллиграфическое письмо – хороший навык, который может быть выработан у каждого ребенка. Скачайте и распечатайте прописи и потренируйтесь со школьником в написании красивых букв. В

Заметьте, что в этих прописях нет картинок или штриховок. В основном эти прописи направлены на тренировку хорошего красивого почерка.

Во время занятий обращайте внимание на то, как ученик держит ручку, как проводит линии. Следите, чтобы ребенок прописывал буквы без отрыва от бумаги. Не ругайте ребенка, если сразу у него не получается писать красивые буквы. Следите, чтобы ребенок начинал писать букву с нужной точки, а не так, как ему нравится. Например, начинают писать заглавную букву Р снизу вверх. Следите за этим. Сейчас во многих прописях даже стоят стрелочки и точки – ориентиры для деток. Покажите им эти стрелочки, объясните для чего они.

Надеюсь, прописи помогут вашему ребенку научиться красиво и правильно писать!

Большое значение при обучении письму цифр имеет определение правильного наклона. При письме в клетке наклон определяется отрезком, соединяющим правый верхний угол клетки с серединой её нижней стороны. Прежде чем приступить к объяснинию написания цифры, необходимо показать ребёнку её образец и проанализировать, из каких элементов состоит цифра (палочка, волнистая линия, овал, полуовал). Показ написания цифры должен сопровождаться краткими пояснениями о том, где начинается линия, в каком направлении ведётся, где заканчивается, в каком месте ручка должна быть оторвана от бумаги и какой будет следующая линия. Первые цифры, написанные ребёнком самостоятельно, должны быть просмотрены взрослым, который делает необходимые замечания.

Особенности написания цифр и образцы цифры

Начинают писать маленькую палочку немного выше и правее центра клетки, ведут линию вверх к правому верхнему углу клетки. Затем пишут большую палочку от верхнего правого угла почти до середины нижней стороны клетки.

Начинают писать немного ниже середины верхней стороны клетки. Ведут линию вверх, закругляя в правом верхнем углу клетки. Затем ведут линию вниз к середине нижней стороны клетки. Вдоль нижней стороны клетки. Вдоль нижней стороны клетки пишут волнистую линию, ведя руку к правому нижнему углу клетки.

Начинают писать немного ниже середины верхней стороны клетки. Ведут линию вверх, закругляя в правом верхнем углу клетки. Затем ведут линию вниз, немного не доводят до середины клетки и пишут нижний полуовал.

Начинают писать немного правее середины верхней стороны клетки. Ведут прямую линию почти к центру клетки, затем ведут палочку вправо и немного не доводят до правой стороны клетки. Пишут длинную палочку, начиная выше середины правой стороны клетки и доводя её до нижней стороны клетки.

Начинают писать наклонную палочку немного правее середины верхней стороны клетки и ведут её почти до центра клетки. Затем пишут полуовал. Сверху от палочки пишут вправо волнистую линию.

Начинают писать полуовал немного ниже верхнего правого угла клетки, закругляют, касаясь верхней стороны клетки, и ведут руку вниз. Закругляют линию, касаясь нижней стороны клетки и ведут руку вверх. Затем закругляют линию влево немного выше центра клетки.

Начинают писать волнистую линию немного ниже середины верхней стороны клетки и доводят её до правого верхнего угла клетки. Потом пишут большую палочку, доводя её почти до середины нижней стороны клетки, а затем перечёркивают её маленькой палочкой посередине.

Начинают писать немного ниже и правее середины верхней стороны клетки. Ведут линию вверх и вправо, закругляют, касаясь верхней и правой сторон клетки. Затем ведут руку вниз, закругляют линию, касаясь нижней стороны клетки. Далее, закругляясь, линия идёт вверх к начальной точке.

Начинают писать немного ниже правого верхнего угла клетки. В правом верхнем углу клетки линию закругляют и ведут руку вниз, к центру клетки. Здесь линию вновь закругляют и ведут вверх к началу овала. Затем ведут руку вниз, закругляя у середины нижней стороны клетки.

Овал начинают писать немного левее правого верхнего угла клетки. Ведут линию вниз, закругляя на середине нижней стороны клетки. Затем ведут руку вверх к началу овала.

Прописи цифр

Сегодняшняя школа предъявляет к приходящим в первый класс детям 6 – 7 лет довольно серьезные требования. Рассчитывать на то, что как когда-то в прошлом дети придут в школу и там их всему научат, уже нельзя. Одним из самых важных признаков готовности малыша к школе является и начальные навыки письма.

Именно для решения этой задачи специалисты разработали прописи. Эти простые закорючки, линии, картинки помогают ему привыкнуть к ручке, разработать руку, сформировать навык написания будущих частей букв и цифр. Чтобы помочь дошколятам в подготовке к школе, родители, благодаря Интернету, могут распечатать прописи для детей 6-7 лет бесплатно.

Но начинать подготовку надо заранее. Первые прописи можно давать малышам уже начиная с трёх лет. Для этого разрабатываются специальные развивающие забавные картинки и узоры для детей 3-4 лет, обводя которые они начинают свое первое знакомство с карандашами и ручками.

Для того чтобы распечатать кликните по картинке, она откроется в специальном окне, далее нажимаете правой кнопкой мыши по картинке и выбираете «Печать»

Раскраски с картинками и самыми простыми линиями и формами становятся для детей первым этапом обучения. Малыш привыкает держать в руках карандаш или кисть, раскрашивая любимых героев. Некоторые раскраски включают в себя и элемент прописей, когда силуэт рисунка выполнен в виде тонкой пунктирной линии. Юный художник обводит её, чтобы сделать рисунок ярким и четким, обучаясь так проводить плавные линии.

Прописи для детей 3-4 лет не включают в себя ни букв, ни цифр. Дошкольники учатся обводить простые геометрические формы, крупные рисунки и линии. Палочки и крючочки встроены в рисунок раскраски. Малыш может вначале раскрасить рисунок, а затем обводить эти элементы.

Взрослые следят за тем, чтобы линия, которую ведет малыш, не прерывалась и не выходила сильно за пределы контура.

Даже если ваши дети перешагнули возраст 3-4 лет, стоит проверить, насколько легко они работают с раскрасками и самыми простыми прописями, прежде чем переходить к следующему этапу. Чем больше дошкольник рисует в раскрасках (любых), тем больше разрабатывается мелкая моторика рук, тем легче ему будет даваться письмо.

Прописи для детей – обучение письму в игровой форме

Буквы и цифры

В возрасте 5-6 лет детей начинают знакомить с буквами и цифрами, осваивать их написание. Вначале учатся правильно писать элементы букв – крючочки и закорючки, палочки и линии. Обязательно включены в прописи для детей 5-6 лет печатные буквы, которые они обводят по пунктирным линиям.

Обучая детей написанию букв, не нужно забывать и про цифры. Научиться писать их не менее сложно для малышей. В этом возрасте дошкольник также начинает с освоения правильного написания элементов цифр.

Вначале на первом этапе работы с прописями букв и цифр, родители держат руку малыша в своей. Так он сможет прочувствовать правильный порядок движения руки. Это очень важно для последующей красоты и правильности написания. После того, как дошкольник понял, как надо действовать, он будет обводить линии сам.

Алфавит для школьников

В возрасте 6-7 лет дети приходят в школу и начинают обучаться русскому языку. Правильность порядка написания букв определяет скорость письма в будущем, красоту и ясность почерка. На то, чтобы отработать это, у педагога в школе нет достаточно времени. Здесь на помощь школьнику приходят родители и прописи. В 6-7 лет дети должны уже осваивать прописные буквы. В прописях стрелочками указано направление движения руки. Родители обязательно должны проконтролировать, чтобы начинающий ученик соблюдал эти указания.

Прописи – математические

Для того чтобы у детей 6-7 лет были успехи в математике, родителям стоит воспользоваться математическими прописями. Они включают в себя примеры написания цифр и их элементов, простые примеры, геометрические фигуры. Если маленький ученик отработает дома написание цифр до автоматизма, не путая, например, 6 и 9, это даст ему больше времени на математике в школе для понимания сути примеров, задач и правил, которые объясняет учитель.

Прописи – Английский язык

Зачастую дети 6-7 лет уже начинают изучать английский язык. Написание имеет свою специфику. Он включает в себя как буквы, соответствующие , так и совершенно незнакомые детям до этого. Даже буквы, похожие на русские, пишутся несколько иначе, а абсолютно новые особенно трудны для освоения. Здесь на помощь учащимся также придут прописи с английскими буквами. Все эти нужные и развивающие прописи можно скачать и распечатать совершенно бесплатно.

Прописные буквы для детей,учим писать русские прописные буквы

В разделе «Прописи», Вы можете бесплатно скачать методические материалы для развития навыков письма, предназначенные для школьников и дошкольников. Также, с помощью прописей можно скорректировать свой собственный почерк или научиться писать другим почерком.

1 | | | |

Ю. Астапова

Прописи предназначены для подготовки детей дошкольного возраста к письму в тетради. Задания помогут развить мелкую моторику и координацию движений руки, формируют графические навыки и воображение ребёнка. Прописи помогут детям научится ориентироваться на листе бумаги в узкую косую линеку, задания разовьют зрительное восприятие, логическое мышление. Заниматься по настоящим прописям можно как индивидуально, так и в группе.

Н.В, Масберг

Перед вами прописи, упражняясь по которым малыш сможет натренировать мелкие мышцы руки и добиться правильной координации пальцев при письме.
Материал в прописях представлен в виде увлекательных заданий на внимательность, точность и координацию движений. Малыш должен научиться проводить различные фигурные и непрерывные линии ровно и красиво, и стараться не отрывать карандаш от бумаги. Выполняя такие задания, он научится аккуратно обводить по пунктирной линии, легко освоит первые навыки письма и рисования, приобретет ловкость при работе с ручкой и карандашом.

Астапова Ю.

Прописи предназначены для подготовки детей дошкольного возраста к обучению письму.
Задания тетради знакомят ребенка с конфигурацией букв русского алфавита. Дети запоминают название букв и их конфигурацию, учатся вписывать в рабочую строку форму буквы, соблюдая ее пропорции, писать буквы на равном расстоянии друг от друга, начинать работу в начале строки слева, соблюдать размеры строки, пользоваться гигиеническими правилами письма.

Издательство “Стрекоза”

Прописи-раскраска, которые призваны помочь развить мелкие мышцы руки и правильную координацию пальцев при письме у детей младшего возраста. Выполняя задания, ребенок освоит первые навыки рисования, письма, обводки, а также научится мыслить и фантазировать. Для учащихся начальных классов.

Трифонова Н.М., Романенко Е.В.

Конспект урока математики для 1 класса “Число и цифра 5”

Государственное учреждение

«Средняя школа имени Н. Островского»

Бородулихинского района

Восточно- Казахстанской области

Конспект урока математики

на тему: «Число и цифра 5»

Подготовила учитель начальных классов

средней школы имени Н. Островского

Сидорина Светлана Валерьевна

с. Бородулиха

2012

Урок математики в 1 классе

Тема: Число и цифра 5.

Класс: 1

Тип урока: Комбинированный урок усвоения новых знаний с применением игровых и мультимедийных технологий.
Продолжительность урока: 35 минут

Используемые педагогические технологии:
• традиционная педагогическая технология;
• информационно-коммуникационная технология;
• элементы технологии организации исследовательской деятельности обучающихся и элементы дифференцированного подхода к обучению.

Материалы и оборудование: компьютерный класс, рабочие тетради обучающихся.

Цели урока:
• познакомить с образованием числа 5 и цифрой 5;
• формировать умение сравнивать числа 1, 2, 3, 4, 5;
• научить соотносить числа 1, 2, 3, 4, 5 с соответствующим множеством предметов;
• научить писать цифру 5.

Требования к уровню подготовки обучающихся:

Обучающиеся по итогам урока должны:
Понимать количественный и порядковый смысл целого неотрицательного числа 5 и смысл действий операций сложения и вычитания над целыми неотрицательными числами.
Знать число и цифру 5, его состав.
Уметь читать и записывать число 5, сравнивать изученное число 5 с помощью знаков (›, ‹ или =). Давать ответы в виде развернутых предложений на вопросы учителя или сказочного персонажа, уметь выполнять инструкции учителя.
Уметь в процессе учебной деятельности контактировать с товарищами в и вести диалоги. Понимать и выполнять учебные требования, предъявляемые со стороны учителя и мультимедиа-персонажей.

Примерный ход урока:

I. Организационная часть.

– Дети, сегодня мы с вами отправимся в путешествие в сказочный лес. (Слайд №1) закройте глаза и послушайте звуки леса. Что вы услышали? (пение птиц: соловья, кукушки, воробья, как шелестят листочки на деревьях, журчание ручья, шуршание и жужжание насекомых)
Как нужно вести себя в лесу?

II. Основная часть.

1. Актуализация опорных знаний

-Скажите, кого вы видите в верхнем левом углу? Это Мудрая Сова и перед тем, как запустить нас в лес, она проверит, знаем ли мы последовательность чисел при счёте. Готовы?

УЧИТЕЛЬ: Назовите число, следующее за числом 1, 2, 3; какое число идет при счете перед числом 4, 3, 2; какое число стоит между числами 1 и 3, 2 и 4; сколько надо прибавить к 1, чтобы получить 2; сколько надо вычесть от 4, чтобы получить 3; от какого числа вычли 1, если получили 3?

УЧЕНИКИ: За числом 1 следует число 2, за числом 2 следует число 3, за числом 3 следует число 4; перед числом 4 идет число 3, перед числом 3 идет число 2, перед числом 2 идет число 1; между числами 1 и 3 стоит число 2, между числами 2 и 4 стоит число 3; к 1 надо прибавить 1, чтобы получить 2, от 4 надо вычесть 1, чтобы получить 3, из 4 вычли 1 и получили 3.
2. Составление числового ряда. Имя следующего персонажа, проживающего в лесу вы узнаете, если отгадаете загадку:

-Она пробежала, хвостиком махнула,

Яйцо упало и разбилось. (мышка)

Теперь попробуем выполнить её задание.(Слайд 2 и 3)

«Поставьте числа в порядке возрастания, а затем в порядке убывания».

3. Счёт предметов до 10. (Слайд 4)

Бежал раз заяц вдоль равнин,

А значит заяц был один.

К нему зайчиха прибежала,

Тогда всего … два зайца стало.

Ещё одни к ним сел, смотри.

Теперь уж зайцев стало три.

Мчит новый заяц: «Путь мне шире».

Ну, стало их теперь четыре.

Ба! Вот бежит один опять

Теперь уж зайцев стало пять.

Спешит ещё один из рощи

Так, значит, зайцев шесть, чего же проще.

Тут прибежал ещё косой,

Так, зайцев 7, ведь он седьмой.

К ним одного ещё попросим,

Тогда всех зайцев будет восемь.

Прыг новый заяц: «В сборе все ведь?»

Он их спросил: «Так нас тут девять?»

« Да, девять»- молвят те в ответ,

« Но вожака всё нет и нет».

А тот бежит, болотце месит,

Примчал и молвит: «Нас тут десять».

( счёт в прямом и обратном порядке)

– Кого мы встретили? (Зайца)

4. Повторение состава чисел 2, 3,4. Встреча с лисицей. (Слайды 5, 6, 7, 8)

УЧИТЕЛЬ. Как вы думаете, какие числа нужно расставить в самый первый домик с голубой крышей? Этот домик стоит слева.
УЧЕНИКИ. В первый домик нужны числа 1.
УЧИТЕЛЬ. А как вы догадались? Какое окошко дает нам с вами подсказку?
УЧЕНИКИ. Окошко на чердаке, там «главное число», в его состав входят числа из окошек первого и второго этажей.
УЧИТЕЛЬ. Очень хорошо! А какие числа вы вставили в окошки второго домика с синей крышей.

УЧЕНИКИ. Во второй домик нужно число1 и 2.
УЧИТЕЛЬ. А в третий домик?
УЧЕНИКИ. В третий домик вставляем числа 2, 1, 3.
УЧИТЕЛЬ. Молодцы! Мы с вами повторили состав чисел… Помогите мне, ребята! Скажите вслух хором!
УЧЕНИКИ (хором). Три, два и четыре!

5. Физкультурная минутка.
УЧИТЕЛЬ. Я думаю, что нам пора отдохнуть. Глазки ваши уже устали.
Чтоб глаза твои зорче были,
Чтоб в очках тебе не ходить,
Эти легкие движенья
Предлагаю повторить.
Вдаль посмотрим и под ноги,
Вправо, влево побыстрей.
Удивимся – что такое?
И закроем их скорей.
А теперь по кругу быстро,
Словно стрелочка часов,
Проведем глазами дружно
Ну а дальше – будь здоров

6. Встреча с волком. (Слайд 9)

Кто зимой холодной,

Бродит злой, голодный? ( Волк)

– У него есть для вас задание.

Решение примеров на сложение по поручению волка. (Слайды 10 и 11)

-Нужно прочитать выражения и найти их значение. Назовите компоненты при сложении. При вычитании?

7. Встреча с медведем. (Слайд 12)

« Он очень толстый, косолапый,

А зимой сосёт он лапу»

(Медведь)

– У вас на парте есть листочки с логическим заданием, подвиньте к себе, возьмите в руку простой карандаш и подумайте, как можно продолжить ряд с фигурками и дорисуйте. (Слайд 13) Проверка в парах.

III. Работа над новым материалом. Знакомство с числом и цифрой 5.

УЧИТЕЛЬ. А теперь давайте поработаем над новой темой.

Отгадайте, какое число мы будем изучать сегодня? Сколько сказочных персонажей встретили в лесу? (Слайд 14)

УЧЕНИКИ: пять!
УЧИТЕЛЬ. Ребята, а чем примечательно это число? Чем оно отличается от других и где встречается?
УЧЕНИКИ. Пять – это самая лучшая оценка в школе, пять пальцев на одной руке, пять лучей у звезды…
УЧИТЕЛЬ. Хорошо! давайте поработаем дальше!

1. Образование числа 5. (Слайд15)Чтение стихотворения про Рябушку, затем работа детей

Практическая работа.
УЧИТЕЛЬ. Выньте из конвертиков фигуры и положите перед собой столько треугольников, сколько рыбок на экране. (слайд 16) Под треугольниками положите столько же квадратов. Сколько квадратов положили?
УЧЕНИКИ. Положили 4 квадрата.
УЧИТЕЛЬ. Добавьте еще один квадрат. Сколько квадратов стало?
УЧЕНИКИ. Стало пять квадратов.
УЧИТЕЛЬ. Как получили пять квадратов?
УЧЕНИКИ. К четырем квадратам прибавили один и получили пять.

У вас больше треугольников или квадратов? На сколько?
УЧИТЕЛЬ. Ой, молодцы! С вами просто радостно сегодня работать и вы заслужили маленькую передышку – физкультурную минутку! Вышли все ребятки из-за парт, встали удобно, вытянули ручки вперед, кисти рук сжали в кулачки! Смотрим на меня и повторяем хором слова и действия!
УЧИТЕЛЬ ВМЕСТЕ С УЧЕНИКАМИ (хором). Раз, два, три, четыре, пять вышли пальчики гулять (из кулачка по очереди распрямляем по одному пальчику), раз, два, три, четыре, пять в домик спрятались опять (по одному пальчику складываем в кулачок). И еще два раза!
УЧИТЕЛЬ. Хорошо! А теперь снова за работу! Занимайте свои места и в путь!

2. Знакомство с цифрой 5.
УЧИТЕЛЬ (демонстрирует карточку с цифрой 5). Ребята, а чей это портрет? Что за незнакомка здесь изображена?
УЧИТЕЛЬ. Это цифра 5. Так записывают число 5.
УЧИТЕЛЬ. Кто из вас раньше видел цифру 5? Где?
УЧЕНИКИ. Цифру 5 мы видели на страницах учебника, на линейке, на монетах, на домах.

3. Формирование умения работать в тетради.
УЧИТЕЛЬ. А чтобы Сова была всеми нами довольна еще больше, давайте потренируемся правильно писать цифру пять (показ образца написания цифры 5).

– И мы сейчас с вами будем учиться писать цифру 5. Откройте свои печатные тетрадочки.
– Палочка, кружок и хвостик…
Что за цифра пришла в гости?
Украсила мою тетрадь
Лучшая отметка – «пять»!

В тетради найдите рабочую строку, где вы будете писать цифру 5: начинаем писать палочку немного правее середины верхней стороны клетки, ведем ее наклонно вниз почти до центра клетки, пишем полуовал, касаясь правой стороны клетки. Сверху от палочки пишем вправо волнистую линию, доходящую до правого верхнего угла клетки.
В тетрадях прописывают цифру 5.

4. Физминутка

Зайчик беленький сидит и ушами шевелит.
Зайке холодно сидеть, нужно лапочки погреть.
Лапки вверх, лапки вниз, на носочки поднимись.
Лапки ставит на бочок, на носочках скок – скок – скок,
А затем вприсядку, чтоб не мерзли пятки.
(Учащиеся, выполняют движения, имитируя повадки животного).

УЧИТЕЛЬ. Ах, как красиво у вас получается! А у кого получилось не совсем так, как он хотел, не беда! Дома в черновике, а потом в прописях обязательно потренируйтесь и у вас обязательно получится!

5. Задание на внимание – слайд 17 «Найди 10 отличий»

IV. Итог урока.

1. Рефлексия

– Чем занимались на уроке?

-Что особенно понравилось?

С какой цифрой познакомились? Какие были затруднения?

Список использованной литературы

1. Учебник «Математика для 1 класса». /Алматы, “Атамұра”, 2010.

2. Г. А. Зайцева «Математика 1 класс». Поурочные планы по учебнику М. И. Моро и др./ «Учитель АСТ», Волгоград 2002.

3. Новокрещенова Л.А. Математика 1 класс. Число и цифра «5» (http://nachalka.info/teachers?note=79)

15 полезных правил написания чисел в английском

В английском языке существуют различные способы правописания чисел. Многие люди с трудом могут разобраться в длинных числах, которые можно было бы записать всего в двух словах. С другой стороны, существуют ситуации, когда нельзя использовать цифры для написания чисел. Попробуем разобраться!

Примечание: Если вы имеете дело со специфическими материалами, относящимися к документации MLA (Ассоциация по развитию языка и литературы) или APA (Американская филологическая ассоциация), следует уточнять правописание чисел в соответствующих рекомендациях этих организаций.

Написание чисел словами

Простые числа в английском следует писать следующим образом:

• over five dollars (более пяти долларов)
• two million pounds (два миллиона фунтов)

Числа, состоящие из десятков и единиц, пишутся через дефис:

• twenty-two years later (двадцать два года спустя)
• sixty-five flowers (шестьдесят пять цветков)

Написание чисел цифрами

Правописание чисел цифрами в английской грамматике включает целый ряд вариантов и зависит от контекста употребления чисел. Например:

• over 90 days (более 90 дней)
• about 10.3 liters (около 10,3 литров)
• 10,5 pounds (10,5 фунтов)
• Just $39.95 (всего лишь 39,95 долларов)

Как видно из примеров, числа в английском правописании могут быть оформлены различными способами. Давайте рассмотрим каждый из них.

Числа в адресах

• 27 Eighth Street
• 225 East 5 Street

Дни и года

Дни, месяца, годы или, проще говоря, даты в английском оформляются следующим образом:

• June 5, 2015 или 5 June 2015 (5 июня 2015 года)
• In 1812 (в 1812 г.)
• In 1993-1995 или in 1993-95 (в 1993-1995 гг.)
• A.D. 476 (476 год нашей эры, 476 г. н. э.)
• The nineties, the 90’s или the 1990’s (девяностые)

Числа в контексте времени

Если речь об определенном времени суток, то правильно писать так:

• 10:00 A.M. (a.m.) или ten o’clock in the morning (10 часов утра)
• 5:30 P.M. (p.m.) или half-past five in the afternoon (полшестого вечера)

Идентификационные числа

• Elizabeth II (Елизавета Вторая)
• Channel 4 (Канал 4)
• Box 37 (Ящик №37)

Нумерация глав и страниц в книгах и пьесах

• Chapter 2 (Глава 2)
• Page 221 (страница 221)
• In act 2, scene 5 или in Act II, Scene v (во втором акте, сцена 5 или акт 2, сцена 5)

Числа в десятичных дробях и процентах

• .08 metric ton (0,08 метрической тонны)
• A 3.33 average (в среднем, 3,33)
• 17.8% (в научной литературе) или 17.8 percent (в обычном контексте)

Правописание больших целых чисел

• Seven million dollars или $7 million (семь миллионов долларов)
• 12,500,000,000 или 12.5 billion (12,5 миллиарда)

Числа в деловой документации

Если вы имеете дело с деловыми документами, строчное написание чисел следует дублировать цифрами. Например:

• The daily profit came up to two hundred fifty (250) dollars (дневная прибыль достигла 250 долларов)

Числа в юридических документах

• The car repair will require $2,480.7. (ремонт машины потребует вложения 2480,7 долларов)

Употребление чисел в статистике

Написание чисел в статистических отчетах должно быть последовательным: или цифрами, или прописью (словами). Например:

• The vote is 105 in favor and 11 opposed (итоги голосования: 105 «за» и 11 «против»)
• Five pears, six apples and ten apricots (пять груш, шесть яблок и десять абрикосов)

Неправильно:

• Five pears, six apples and 10 apricots (пять груш, шесть яблок и 10 абрикосов)

Числа в начале предложения

В грамматике английского языка считается правильным начинать предложение только с прописного числа. Например:

• Three percent of the apples were broken during transportation (три процента яблок были повреждены во время транспортировки)

Однако нельзя использовать число в виде цифры в начале предложения:

• 3% of the apples were broken during transportation

Комбинированное написание чисел

Допускается использование прописных чисел и цифр в одном предложении с целью сделать написанное более понятным. Например:

• There are 12 90-year-olds living in our town (в нашем городке живет двенадцать девяностолетних человек) — здесь два числа, 12 и 90, читатель может принять за одно: 1290.
• There are twelve 90-year-olds living in our town — подобное написание значительно облегчает восприятие текста.

Читаем дальше:

Как правильно писать даты в английском языке

Как правильно писать русские имена английскими буквами?

Учимся писать цифры 5 6 лет. Замечательные варианты прописей цифр для детей. Особенности написания цифр и образцы цифры

Прописи – замечательная придумка взрослых, для развития навыков письма у детей. Использовать прописи можно с самого раннего возраста, начиная с 3 лет.

Сейчас можно найти огромное количество прописей. Главное, подобрать прописи для ребенка, соответствующие его возрасту. На этой странице вы сможете бесплатно скачать и распечатать прописи для детей 3-4 лет, 5-6 лет (дошкольников) и первокласcников.

Не стоит начинать занятия сразу с прописей цифр, букв и слов – это очень сложно. Малышам в 3-4 года будут интересны прописи с увлекательными заданиями на внимательность, точность и координацию движений.

Это прописи с достаточно простыми фигурами, линиями, различными завитками. Пусть малыш сначала потренирует руку, обводя фрагменты картинок, забавные крючочки и палочки.

Малыш должен научиться проводить различные фигурные и непрерывные линии ровно и красиво, стараться не отрывать карандаш от бумаги. Это не так просто.

Скачать прописи для малышей

Прописи И.Попова отлично подойдут малышам для самых первых занятий. Палочки и крючочки встроены в рисунки прописи. Сначала можно раскрасить рисунок, а потом перейти к “строчному письму”.

Скачать прописи для мальчиков

Веселые прописи для детей 5-6 лет

Для детей 5-6 лет возьмите прописи с более трудными заданиями. Используя такие прописи, ваш ребенок научится аккуратно обводить пунктирные линии, освоит первые навыки письма и рисования, приобретет ловкость при работе с ручкой и карандашом.

Скачать прописи для детей 5-6 лет

Скачать весёлые прописи для дошкольников

Прописи для дошкольника подготовят ребенка к письму, познакомят его с конфигурацией букв русского алфавита, научат писать буквы прописью. Используйте данные прописи, и ваш ребенок быстрее запомнит название и написание букв.

Скачать прописи – алфавит для дошкольников

Прописи по математике с цифрами и задачками помогут ребенку заранее научиться правильно писать цифры и познакомиться со счетом. Нажав на ссылку, вы можете скачать несколько видов прописей по математике быстро и бесплатно

Скачать прописи с цифрами

Прописи для школьников

Чтобы выработать красивый почерк, ребенку потребуется не мало времени. Но сейчас в школе очень мало уделяют внимания на правильное и каллиграфическое написание букв и цифр. Поэтому вы можете распечатать прописи с алфавитом для школьников и дополнительно заниматься. Эти прописи – без картинок, направлены на более серьезную работу по обучению письму. Кроме самих букв в прописях есть и отдельные элементы букв.

Скачать прописи для школьников “Алфавит прописью”

Знакомя ребенка с математикой в дошкольном возрасте, родители стараются привить любовь к этой науке. Прописи цифры помогут малышу научиться писать числа красиво и правильно. Написать цифры прописью вовсе не так легко. На освоение этого навыка в школе у непоседливого первоклассника часто не хватает времени и сил, поэтому к пятому классу его тетради по математике выглядят весьма печально. Как научить ребенка писать цифры, занимаясь с ним дома, чтобы занятия были в радость и на пользу?

Из этой статьи вы узнаете

Когда начинать

В каком возрасте лучше учить ребенка писать цифры прописью зависит не только от желания родителей. Многие хотят пораньше обучить своего малыша, как правильно писать цифры. Но если у ребенка еще неразвита мелкая моторика рук, он не умеет считать, и заниматься ему не очень хочется, покупать прописи с цифрами еще рано. Опытные педагоги не советуют предлагать прописи цифры для детей в три–четыре года по нескольким причинам:

• формируются неправильные навыки письма, так как ребенок еще не способен оценить прием написания чисел;
• у ребенка пропадает интерес осваивать новый материал в школе, если учитель объясняет то, что ему давно знакомо и успело надоесть;
• ребенок должен получить начальную подготовительную базу, которая включает умение держать ручку, ровно сидеть за партой, быть аккуратным и внимательным;

Когда малыш сам выявит желание заниматься, заполняя пропись цифр, можно скачивать материал для обучения из интернета бесплатно. Скачать прописи для дошкольников и распечатать можно самые разные: с картинками раскрасками, с узорами из различных элементов, образец, который нужно обводить по точкам. Первые занятия должны проходить в игровой форме и не утомлять ребенка.

Упражнения для развития мелкой моторики

Распечатанный цифровой образец, который нужно обвести, является хорошим упражнением для развития мелкой моторики. Но в два или три года давать ребенку прописи еще рано. Начинать нужно с простых занятий аппликацией, лепкой из пластилина или соленого теста.

Можно делать самостоятельно или покупать в игрушечных магазинах сенсорные коробки с сыпучими материалами, фигурками зверей из пластика или резины, камешками разной формы и размера. Построение из элементов игры различных сценок будет способствовать развитию мелкой моторики рук ребенка с одного года.

С малышом старшего возраста можно заниматься нанизыванием бус на ниточку. В качестве бус могут служить большие пуговицы, крышечки от пластиковых бутылок, деревянные катушки из-под ниток.

Нужно делать с малышом пальчиковую гимнастику, рассказывая забавные стишки про сороку-ворону, которая кашу варила и деток кормила, про зайчиков и белочек, про мальчиков и девочек.

Можно устраивать театр теней при помощи рук, складывать оригами, плести макраме, делать фигурки и браслеты из резинок, вырезать новогодние снежинки, плести фигурки из крупного бисера. Собирание мелкого конструктора тоже прекрасно развивает мелкую моторику пальчиков, но старайтесь не давать мелкие детали деткам до трех лет, чтобы они их случайно не проглотили.

Важно научить ребенка правильно держать карандаш и ручку. Чтобы карандаш лежал на среднем пальце руки, будучи зажат большим и указательным пальцами, потренироваться придется долго. Не ругайте малыша, если он держит карандаш неправильно, раскрашивая картинки. Объясните, что если он хочет научиться рисовать и писать, карандаш нужно держать, так как это делает мама или папа. Хвалите ребенка за старание и малейшие успехи, стараясь не замечать промахов и ошибок.

Как проводить занятия

Учимся писать цифры играя. Урок письма должен стать не сухим заучиванием правил написания по клеточкам, а творческим занятием, развивающим воображение. Желательно, чтобы ребенок понимал то, что он пишет. Учить значение чисел можно с двух лет.

В пять лет можно начинать учить, как пишутся числа в прописях. Сначала необходимо объяснить ребенку, из каких частей состоит клетка в тетради. Где у нее верхняя сторона, где нижняя, правая и левая. Малыш должен сам находить центр клетки. Правильное написание цифр – это мамина гордость. Но нельзя торопить малыша.

Навык письма формируется по наблюдениям психологов в течение нескольких лет жизни. Привычка выполнять задание торопливо и небрежно, чтобы быстрее окончить урок и заняться более интересными делами – это нежелательное поведение, которое нужно сразу корректировать. Вносить в дошкольный период обучения элемент игры можно самыми разными способами.

Заполнение прописи

Заполняя с ребенком прописи пишем цифры правильно, чтобы в школе не пришлось переучиваться. Правила написания по клеточкам от 1 до 10 показывают малышу в виде небольших карточек со стрелками, так он лучше поймет движение ручки во время письма и запомнит.

Вариант для цифры 1

Письмо цифры 1 начинается почти от середины клетки. Рисуют короткую палочку до угла клеточки. Потом вниз из правого угла длинную палочку, которая опускается на сторону основание клеточки.

Вариант для цифры 2

Писать цифру 2 начинают выше центра клеточки. Рисуют плавный полукруг, который касается середины правой части верха клеточки и середины верхней части правой стороны клеточки. Плавно закругляясь в виде ровной палочки, полукруг числа два опускается на черту-основание клетки немного левее середины. Теперь рисуют хвостик, который красивой волной упирается в правую сторону клеточки недалеко от основания. На этом письмо цифры 2 окончено.

Вариант для цифры 3

Число три состоит из двух полуокружностей. Начинают писать из точки, которая находится немного ниже середины верхней грани клеточки. Закругляя, ведут полуовал, который соприкасается с верхней гранью и с правой, ближе к углу. Оканчивается верхний полуовал чуть выше и правее центра клетки. За ним рисуют второй полуовал, который опирается одним боком на правую сторону клеточки и, доходя до основания, оканчивается чуть левее его середины.

Вариант для цифры 4

Число четыре так же как один, не имеет симпатичных округлостей и плавных линий. Она состоит из прямых линий и углов. Письмо цифры 4 начинают из точки, лежащей на середине правой части верхней грани. Ведут линию до точки, которая находится немного ниже центра клеточки. Рисуют угол, со стороной параллельной основанию. Останавливаются, не доходя до правой стороны. Из точки, лежащей немного выше середины правой стороны, рисуют под наклоном линию до основания клеточки.

Вариант для цифры 5

У числа пять рисуют ровную палочку вниз, по направлению к центру, из точки немного правее середины верхней грани клеточки. Красивый полукруг, отходящий от палочки, соприкасается с правой стороной клеточки посредине и опускается на сторону основание клетки. В конце из начальной точки рисуют хвостик в виде полукруга, который упирается в угол клеточки.

Вариант для цифры 6

Число шесть похоже на девять, которое поставили на голову. Начинают писать шестерку из точки на правой стороне клеточки, недалеко от верхнего угла. Ведут полукруглый хвостик до нижней стороны клеточки. Против часовой стрелки рисуют овал, который занимает чуть больше одной четвертой части пространства.

Вариант для цифры 7

Число семь пишут почти так же, как один. Только начинают вести не ровную линию, а плавную, как волну, из точки немного ниже середины верхней грани клеточки. Потом из правого угла клетки рисуют ровную ножку до основания, немного правее середины. Перечеркивают ножку цифры посередине короткой ровной чертой слева направо.

Вариант для цифры 8

Писать цифру 8 проще простого. Рисуют полукруг, как для числа два, начиная вести из точки немного выше центра клетки. На основании закругляют линию и рисуют второй полукруг больше, возвращая ручку в первоначальную точку написания числа восемь.

Вариант для цифры 9

Писать цифру 9 нужно из точки, которая находится в середине верхней части правой стороны клетки. Нарисовав небольшой овал, который почти помещается в одной четвертой части клетки, возвращаются в первоначальную точку и рисуют полукруглую ножку у овала. Ножка овала, доходя до середины основания клетки, закругляется немного вверх.

Вариант для цифры 0

Ноль, похожий на круглый бублик, начинают рисовать из точки, которая лежит на верхней грани клетки, недалеко от правого угла. Движение идет против часовой стрелки, через центр клетки, опускается на ее основание посередине и возвращается в исходную точку, соприкасаясь с правой стороной клетки вверху.

Освоив, как красиво писать первый десяток чисел, не забывайте повторять с ребенком простые правила сложения и вычитания. Тогда красиво написанные числа в тетради по математике для 1 класса будут стоять в правильно решенных задачках.

Вы находитесь в категории раскраски Прописи цифры. Раскраска которую вы рассматриваете описана нашими посетителями следующим образом “” Тут вы найдете множество раскрасок онлайн. Вы можете скачать раскраски Прописи цифры и так же распечатать их бесплатно. Как известно творческие занятия играют огромную роль в развитии ребенка. Они активизируют умственную деятельность, формируют эстетический вкус и прививают любовь к искусству. Процесс раскрашивания картинок на тему Прописи цифры развивает мелкую моторику, усидчивость и аккуратность, помогает узнать больше об окружающем мире, знакомит со всем разнообразием цветов и оттенков. Мы ежедневно добавляем на наш сайт новые бесплатные раскраски для мальчиков и девочек, которые можно раскрашивать онлайн или скачать и распечатать. Удобный каталог, составленный по категориям, облегчит поиск нужной картинки, а большой выбор раскрасок позволит каждый день находить новую интересную тему для раскрашивания.

Образец написания цифры 5 – blinantelhitigu’s blog

образец написания цифры 5

Скачать: Урок математики . Оборудование: Учебник «Математика» 1 (УМК Моро М.И. Показ образца написания цифры 1. Содержит в себе: образцы правильного написания цифр от 1 до 9, стихи на каждую цифру, пословицы и поговорки на каждую цифру. И др распечатки для сравнения групп предметов, карточки с образцом написания цифры «5 тетради с. Напишите цифры по образцу. Цели: Ознакомление с числом и цифрой 5, с получением числа 5, Изучение Оборудование: карточки с цифрами, образец написания цифры 5, на. В тетради найдите рабочую строку, где вы будете писать цифру 5. Наиболее оптимальный способ написания римских цифр в word вы выбираете для себя сами. Помогите пожалуйста, очень прошу помогите. Цифра 5 состоит из маленькой.Развернутый алгоритм написания цифры 5. Литература 5 класс. При правильном написании римских цифр вначале пишутся тысячи и сотник, а потом уже десятки и единицы, если же большая цифра стоит перед меньшей, то. Прописная цифра один (1). Она поможет продемонстрировать учителю все этапы начертания цифр. Для этого сравните каждый шаг в написанной вами цифре с образцом учебника и поставьте зеленым карандашом черточку (корону) над. Данный материал предназначен для показа образца написания цифр. Образцы каллиграфического написания букв и цифр. Первыми идут цифры, выделенные чёрным жирным шрифтом – это образцы, на которые должен. Чтобы правильно написать цифры в прописном варианте, попросите малыша сначала обвести образцы. Показ образца написания цифры 5 на интерактивном плакате, сопровождающийся следующими пояснениями: – Начинают писать немного правее середины верхней.Образец написания цифры 2. Предлагаем вам подборку уроков с 1-го по 4-й классы. Цифра 5 состоит из маленькой прямой палочки, правого полуовала и горизонтальной волнистой линии. Учитель на доске показывает образец написания цифры 5. Оборудование: образец написания цифры 7, рисунки с. Посмотрите, как меняется количество цифр на строке. Это и уроки изучения нового материала, и уроки закрепления знаний. В этом видео 20 раз показывается правописание цифры 5. Показ образца написания цифры 5 на интерактивном плакате, сопровождающийся следующими пояснениями:. О разработке единых образцов каллиграфического написания цифр, украинских и. Комплект содержит 20 отдельных карточек с образцами каллиграфического написания букв и цифр, методические рекомендации”.Римские цифры используются для обозначения веков (XII век), месяцев при указании даты на монументах (21.V.1987), времени на циферблатах часов,. Зелёный шаблон русского алфавита с буквами и цифрами. Образец написания цифры 5. Прежде чем приступить к объяснению написания цифры, необходимо показать детям ее образец, вместе рассмотреть его, выяснить. Цель урока: изучить число 5, его состав, написание цифры 5; развивать мыслительные операции, математические. Число и цифра «5» Урок «Число и цифра «5» по своему типу является уроком. Большое значение при обучении письму цифр имеет определение правильного наклона. Чтобы пользоваться предварительным просмотром создайте себе аккаунт (учетную запись). О разработке единых образцов каллиграфического написания цифр,. Задания по написанию цифр с использованием наглядностей. Полноценное речевое развитие – основа будущего обучения ребенка письму и чтению.Развивающие Мультфильмы для детей. Но правильно использовать второй вариант. Попробуйте в парах проговорить последовательность написания цифры 5. Чтобы от 5-ти отнять 3, нужно взять линеечку, найти на ней цифру 5,. Тема: «Число и цифра 5». Поэтому ноль могли первое время рассматривать как ограничительный знак, а значит и его название вполне могло произойти от. Найдите образец написания цифры 5 на странице 41 учебника. Напишите пожалуйста основные достижения культуры древнего китая. Существует много общих моментов, в обучении написанию цифр и букв. Образец написания цифр для 1 класса. Урок математики в 1 классе по теме Число и цифра 7 18 июл 2010.Ставим ручку в начальную позицию и уходим по стороне клетки на 1/3 вправо до угла». Давайте потренируемся правильно писать цифру пять (показ образца написания цифры 5). Пропись для правильного написания цифр” предназначена для развития у детей дошкольного и младшего школьного возраста умения. Обучающий ролик “Учимся писать цифру 5” поможет Вашему. Целые: 2, 4, 8 Вещественные: 2. Оборудование: карточки с цифрами, образец написания цифры 5, предметные картинки I Организация класса на работу. Нажмите на букву и она откроется в большом размере . Особенности написания цифр и образцы цифры. Данные раскраски предназначены для детей дошкольного возраста, которые начинают изучать цифры от 1 до 5.. Предложите, пож-та, табличку с прописными цифрами в крупных клеточках с направлением движения руки (стрелочками) на одном листе.

Цифра «1. Дидактический материал по математике

Марина Бебко
Знакомим детей с цифрами «Цифра «1»

Цель : Закрепить умение находить много предметов и один предмет. Называть количество предметов, согласуя числительное один с существительным в роде, числе, падеже. Познакомить с цифрой 1 , обозначающей число один. Упражнять в сравнении предметов по высоте, учить ориентироваться в пространстве.

Материал : гномик, ручеек, высокие и низкие деревья, зайчиха и зайчонок, морковка, бельчиха, и бельчонок, орех, грибок, солнце, цифра 1 ; карточки с изображением цифры 1 , цветные карандаши на каждого ребенка; фланелеграф.

Ход занятия:

Воспитатель : Сегодня я расскажу вам историю о Гномике, который живет в лесу. Он очень добрый и веселый, дружит со всеми зверюшками. А еще он очень любит заниматься математикой. Познакомиться с ним . Для этого нужно отправиться в лес и посмотреть, что же там делает Гномик. Что такое лес? Что растет в лесу? (Деревья) (Показывает на ручеек, расположенный на фланелеграфе) А это что такое? (Лесной ручеек) Возле него растут разные деревья. (Выставляет высокое дерево – дальше от ручейка, а низкое дерево – ближе) Какие деревья по высоте? (Высокие и низкие) Где находится низкое дерево? (Ближе к ручейку) А высокое? (Дальше от ручейка)

Предлагает двум-трем детям взять по одному дереву и «посадить» их, рассказав, где они расположили высокие деревья, а где – низкие. Обращает внимание на то, что дети «посадили» по одному дереву, и их стало много. Получился лес.

Физкультминутка

Ветер дует нам в лицо

Закачалось деревцо.

Ветерок все тише, тише,

Деревцо все выше, выше!

Воспитатель : (продолжает рассказ, сопровождая его показом на фланелеграфе) Однажды Гномик гулял по лесу, вдруг набежала тучка, загремел гром, подул сильный ветер, пошел дождь.Слышит Гномик : кто-то плачет.Это зайчонок : он весь промок, продрог, маму потерял. Сколько зайчат нашел Гномик? (одного зайчонка) Взял его Гномик с собой, согрел, и пошли они дальше.Слышит : кто-то пищит.Это бельчонок : он выпал из дупла во время грозы. Взял и его Гномик с собой. Сколько бельчат нашел Гномик? (одного бельчонка) «Где же спрятаться от дождя?» – думает Гномик.Смотрит : «стоит Антошка на одной ножке» Что это? (гриб) Как вы думаете, что происходит с грибами во время дождя? Верно, они растут. Вот и наш гриб стал большим. Всем хватило места спрятаться под ним. Когда дождь закончился, выглянуло солнце. Прибежала зайчиха, поблагодарила Гномика за то, что он спас зайчонка, и подарила ему одну морковку.

Тут и белка прыг-скок с ветки на ветку : «Спасибо тебе, Гномик, что спас моего бельчонка. Угощайся» , – и подарила Гномику орех. Положил Гномик в один карман морковку,в другой орех и думает : «Как бы не забыть, по сколько у меня разных угощений» . Вдруг слышит,кто-то говорит : «Не забудешь, если возьмешь меня с собой» .Смотрит : палочка стоит, очень странная на вид.И поет песенку : «Похожа единица на крючок, а может на обломанный сучок» . «Кто ты?» – спрашивает ее Гномик. «Я цифра 1 , или единица. Я обозначаю число один» , – ответила палочка.

Дети,давайте вспомним : Сколько зайчат нашел Гномик? (одного) Сколько бельчат он спас от дождя? (одного) Сколько морковок подарила зайчиха Гномику (одну) Сколько орехов подарила белочка Гномику? (один) (Воспитатель обозначает на фланелеграфе каждое множество цифрой ) Дети, число один, записывается цифрой 1 .

Гномик : Спасибо, дети, вы помогли мне все правильно сосчитать и запомнить цифру 1 . Я такую же цифру 1 прикреплю к своему домику, и у меня будет дом с номером 1.

На закрепление : Детям раздают карточки с изображением цифры 1 , предлагают обвести ее контур и нарисовать под ней одну морковку или один орех.

Публикации по теме:

Дидактическая игра “Веселый счет до 5” Цели: Продолжать знакомить детей с цифрами 1,2,3,4,5. Учить считать в прямом и обратном порядке.

Как я писала раньше, игра – является ведущей деятельностью для дошкольника. Математические игры – это отличная возможность обучить детей.

Игра – является ведущей деятельностью для дошкольника. Игры с целью развития познавательной активности ребенка, позволяют ему в простой.

Конспект занятия по математике для средней группы «Знакомство с цифрами 1 и 2» (4–5 лет) Тема: Знакомство с цифрами 1 и 2 Цель: – Познакомить детей с цифрами 1 и 2, соотносить цифры и соответствующие им количество.

Конспект занятия «Знакомство с цифрами 1 и 2» Задачи. Продолжать учить детей соотносить цифру с количеством предметов. Учить понимать учебную задачу и выполнять ее самостоятельно, высказывать.

Знакомим детей дошкольного возраста с нетрадиционными техниками рисования Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение МБДОУ №33»Малинка» МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА: «Знакомим детей дошкольного.

Муниципальное автономное учреждение дополнительного образования

«Центр детского творчества»

муниципального образования Выселковский район

Рабочая тетрадь

для детей 4-5 лет

« Готовимся к школе.

ЧИСЛА И ЦИФРЫ 1 – 10»

педагог дополнительного образования

Чимшит Любовь Михайловна

станица Выселки

2017г.

Пояснительная записка.

Рабочая тетрадь предназначена для совместной работы педагога

дополнительного образования в школе раннего развития или родителя с ребёнком 4-5 лет, не посещающим детские учреждения.

В тетради представлены учебно-игровые развивающего характера задания, направленные на последовательное усвоение детьми представлений и понятий о числах и цифрах от 1 до 10.

Основное назначение заданий – способствовать формированию зрительного образа цифр, установлению связи числа с цифрой, развитию произвольного внимания, логического мышления, мелкой моторики и координации движений руки.

При составлении заданий для рабочей тетради были использованы учебные пособия:

Л.Г. Петерсон, Е.Е.Кочемасова «Игралочка» Часть1, 2;

С.В.Гаврина, Н.Л.Кутявина, Н.Т.Топоркова, С.В. Щербинина

«30 заданий для успешного развития ребёнка» Часть1,2;

Е.Деньго «Математика в играх, стихах и загадках»;

Е.Бортникова «Изучаем состав чисел»;

стихи о цифрах С.Я.Маршака из книги «Весёлый счёт».

Задания по теме: Число и цифра 1.

Сколько ежей? Какой ёж идёт вправо? Влево?

Сколько ёлок? Сколько шишек слева, справа?

(Вспомнить понятие «одинаково»)

Каких предметов один?

(Раскрасьте)

№2.

Соедините линией карточки, на которых нарисовано по одному предмету.

(Раскрасьте верхний предмет красным цветом, нижний синим)

№3. Знакомство с числом и цифрой 1.

Заучивание стихотворения о цифре 1.

Письмо цифры 1 по точкам.

Нахождение цифры 1 и обведение её в круг.

Какие цифры напечатаны в рамочке слева?

(Раскрасьте один шар, один цветок, 1 машинку).

№5. Повторение ранее изученного. Подготовка к знакомству с числом 2.

Сколько гусениц?

Где длинная гусеница, а где короткая? (вверху, внизу)

(Раскрасьте длинную гусеницу зелёным цветом, а короткую – жёлтым)

№6.Повторение ранее изученного. Подготовка к знакомству с числом 2.

Какое дерево нарисовано внизу?

Сколько берёзок?

Какая берёзка слева, справа?

(Раскрасьте низкую берёзку зелёным цветом, а высокую- жёлтым)

Задания по теме: Число и цифра 2.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1. Получение числа 2.

Сколько яблок? клубничек?

(Раскрасьте левое яблоко зелёным цветом, а правое красным).

Как получили 2?

Сколько морковок?

(Раскрасьте длинную морковку в оранжевый цвет, а короткую- в жёлтый)

Как получили 2?

Сколько клубничек?

(Раскрасьте большую клубнику красным цветом, а маленькую – зелёным)

Как получили 2?

Знакомство цифрой 2. Наклеивание печатной цифры 2 на вопросительный знак.

Заучивание стихотворения о цифре 2.

№2. Какое животное изображено на рисунке? Сколько их? Какие они?

(Раскрасьте столько кружочков, сколько у нас слонов).

№3. Упражнение в узнавании числа 2.

Найти цифру 2 и обвести её в круг.

№4.Закрепление, повторение ранее изученного.

Сколько мальчиков, девочек на рисунке? Как получили 2?

У кого ленточка длиннее, короче.

(Раскрасьте длинную ленточку синим карандашом, а короткую- красным).

№5. Соотнесение числа и цифры.

В каждом ряду раскрасьте столько предметов, сколько обозначает цифра слева.

Какие листики слева? Сколько их? Соедините линией рисунок с цифрой два.

Задания по теме: Число и цифра 3.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1.Повторение ранее изученного. Работа по новой теме.

Проведи дорожки от большой машины к большому гаражу,

от машины поменьше – к гаражу поменьше, от самой маленькой – к самому маленькому гаражу.

Сколько машин на рисунке?

Три – это один, один и ещё один. Или два и один. Один и два.

(Проговаривают хором, показывая на рисунке)

№2. Знакомство с числом и цифрой3.

Заучивание стихотворения о цифре 3.

Письмо цифры 3 по точкам.

Нахождение цифры 3 и обведение её в круг.

№3. Повторение геометрических фигур. Счёт треугольников.

Сколько треугольников необходимодля ёлочки? Как их надо расположить?

(Наклеивание треугольников справа на листе).

№4. Соотнесение числа и цифры.

В каждом ряду закрасьте столько предметов, сколько обозначает цифра слева. Как закрасили?

В каждом нижнем прямоугольнике обведите по точкам цифру, соответствующую количеству геометрических фигур в верхнем прямоугольнике.

№6. Соотнесение числа и цифры. Диагностика знаний.

Сколько яблок? Соедините линией рисунок с цифрой один.

Сколько ромашек? Соедините линией рисунок с цифрой три.

Какие листики справа? Сколько их? Соедините линией рисунок с цифрой два.

Задания по теме: Число и цифра 4.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1.Повторение ранее изученного. Работа по новой теме.

Сколько котят в корзинке? Какой по счёту будет кошка?

(Раскрасьте оранжевым цветом столько кружочков, сколько у нас котят. Раскрасьте чёрным цветом столько кружочков, сколько у нас кошек.

Сколько всего кружочков? Как получили число 4?)

№2. Знакомство с числом и цифрой 4.

Заучивание стихотворения о цифре 4.

Письмо цифры 4 по точкам.

Нахождение цифры 4 и обведение её в круг.

№3. Письмо цифры 4 по точкам. Соотнесение числа и цифры.

В каждом ряду закрасьте столько предметов, сколько обозначает цифра слева.

№4.Закрепление по теме.

Сколько груш? Как можно по-разному закрасить их жёлтым и зелёным цветом? (3и1; 2 и 2)

Письмо цифры 4 по точкам.

№5 Закрепление знаний об изученных числах и цифрах.

Сколько шариков в верхнем левом прямоугольнике?

Сколько шариков в нижнем левом прямоугольнике?

(Раскрасьте в этом прямоугольнике цифру, которая обозначает количество шариков в нём).

Сколько шариков в верхнем правом прямоугольнике?

(Раскрасьте в этом прямоугольнике цифру, которая обозначает количество шариков в нём).

Сколько шариков в нижнем правом прямоугольнике?

(Раскрасьте в этом прямоугольнике цифру, которая обозначает количество шариков в нём).

№6. Соотнесение числа и цифры. Диагностика знаний.

Сколько белочек? Соедините линией рисунок с цифрой два.

Сколько лягушек? Соедините линией рисунок с цифрой три.

Сколько ежей? Соедините линией рисунок с цифрой четыре.

Сколько зайцев? Соедините линией рисунок с цифрой один.

Задания по теме: Числа и цифры 1- 4. Закрепление.

№1.Найди и исправь ошибку.

Где ошибка? Как исправили?

№2. Соотнесение числа и цифры.

Рассмотрите рисунки. Сосчитайте, сколько вишен (груш, яблок, лимонов)?

Зачеркните ненужную цифру. (Какую зачеркнули?)

№3. Соотнесение числа и цифры. Самостоятельная работа.

№4. Повторение геометрических фигур. Сравнение количество предметов.

Знак « равно».

№5. Сравнение количество предметов. Знаки «больше», «меньше»

Сколько грибов собрала девочка, мальчик? Кто собрал больше?

(Ставим знак, проговариваем)

Какие грибы есть нельзя? (Зачёркиваем их). Сколько съедобных грибов теперь у девочки, мальчика? (Проговариваем полученное неравенство)

№6.Задание на логику.

Раскрасьте цифру, которая обозначает количество зайцев в корзине.

(Объяснение выбора цифры)

№7. Задания на развитие внимания. Повторение геометрических фигур, знаков «плюс», «минус», «точка». Самостоятельная работа.

№8. Задания на развитие внимания. Повторение геометрических фигур, понятий «справа», «слева».

Задания по теме: Число и цифра 5.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1.Порядковый счёт предметов. Закрепление понятий: « стоит за, после», «стоит перед», «стоит между».

На каком по счёту месте матрёшка, мишка, кошка, кукла и тд.?

Сколько всего игрушек?

№2. Получение числа 5.

Нарисуй в прямоугольнике столько кружков, сколько ворон на картинке.

Сколько ворон летает? (Закрасьте последний кружок простым карандашом)

Сколько ворон? Как получили число 5?

№3. Знакомство с числом и цифрой 5.

Заучивание стихотворения о цифре 5.

Письмо цифры 5 по точкам.

Нахождение цифры 5 и обведение её в круг.

№4. Соотнесение числа 5 и цифры 5.

Беседа о времени года на рисунке, о листьях, плодах, животных осенью.

Закрасьте столько кружочков, сколько листиков на земле.

Письмо цифры 5 по точкам.

№5.Соотнесение числа и цифры. Закрепление зрительного образа цифр.

Сколько карамелек? Соедините линией рисунок с цифрой два.

Сколько вишен? Соедините линией рисунок с цифрой четыре. (И тд.)

№6. Соотнесение числа и цифры. Диагностика знаний.

На каждом рисунке раскрасьте столько бусин, сколько показывает цифра в квадрате.

Задания по теме: Числа и цифры 1- 5. Закрепление.

№1. Соотнесение числа и цифры. Закрепление зрительного образа цифр. Развитие внимания. Впомнить сказки.

Проведите линии от числа к героям сказок, поставьте нужное количество точек.

№2. Соотнесение числа и цифры. Состав числа 5.

Обведите по точкам цифру, обозначающую количество утят и уток на картинке.

Сколько утят? Уток? Всего? Как получили 5?

№3.Повторение геометрических фигур. Счёт их(показывают нужную цифру, доставая её из конверта с цифрами).

Самостоятельная работа (развитие внимания).

№4.Порядковый счёт предметов. Закрепление понятий: « стоит за, после», «стоит перед», «стоит между». Вспомнить героев сказок.

Поставьте точки и проведите линии.

Кто стоит пятым? Найдите в конверте цифру 5 и наклейте её под Красной Шапочкой.

№5. Повторение геометрических фигур. Самостоятельная работа.

Рассмотрите коврик в рамке. Найдите такой же и раскрасьте.

Какие фигурки раскрасили красным цветом?

Синим? Жёлтым?

№1. Повторение. Порядковый счёт предметов. Закрепление понятий: « стоит за, после», «стоит перед», «стоит между».

Кто лишний? Почему?

Сколько птиц, зверей? Всего? Как получили число 4?

№2.Повторение чисел и цифр 1-3.

Счёт3-1; 1-3.

Поставьте в нижней клетке столько точек, сколько показывает цифра в верхней клетке.

№3. Повторение чисел и цифр 1-4.

Счёт1-4; 4-1.

Соотнесите число и цифру. Проведите линию от овала к числу.

Назовите одним словом предметы.

№4.Повторение понятий: « шире», «уже», «слева», «справа», времён года.

Самостоятельное раскрашивание рисунка после разбора задания.

№5. Соотнесение числа и цифры. Вспомнить героев сказки.

№6. Упражнение в счёте предметов, обобщении понятий, нахождении лишнего.

Раскрашивание картинок, на которых нарисовано 5 предметов.

Задания по теме: Счёт предметов. Числа и цифры 1- 5. Закрепление.

(Последовательность выполнения заданий может быть разной).

№1.Соотнесение числа и цифры. Закрепление зрительного образа цифр.

Сколько игрушек на каждой полке?

Соедини полки с нужными цифрами.

№2. Повторение геометрических фигур. Сравнение количество предметов.

Знак « равно».

Обведите по точкам цифру, соответствующую количеству кругов и квадратов.

№3.Задание на логику.

Раскрасьте столько кружков, сколько зайцев на картинке.

(Объяснение детьми, сколько кружков они раскрасили).

№4. Соотнесение числа и цифры. Повторить понятия« стоит за, после», «стоит перед», «стоит между».

Какие цифры напечатаны в 1 прямоугольнике? Какое будет следующее?

В пустом кружке нарисуйте подходящее количество точек. (Сколько?) И тд.

№5. Соотнесение числа и цифры. Самостоятельная работа (Диагностика знаний цифр 1-5).

№6. Повторение геометрических фигур. Счёт их количества.

Наклеивание таких геометрических фигур справа.

№7. Соотнесение числа, цифры. Выбор цвета в соответствии с цифрой. Раскрашивание домиков самостоятельно.

Задания по теме: Счёт предметов. Числа и цифры 1- 5.

(Мониторинг знаний по данной теме)

№1. Счёт предметов.

Сколько стульев?

Раскрасть стул, который выше красным цветом.

А стул, который ниже – синим цветом.

№2. Порядковый счёт предметов. Название цветов.

Поставьте столько точек, какой по счёту цветок.

Раскрасьте первый цветок красным цветом. Третий – жёлтым.

Пятый – оранжевым. Второй –голубым. Четвёртый – синим.

№3.Сравнение количества предметов.

Какие листья на ветке слева? Сколько их? Достаньте из конверта нужную цифру и наклейте её внизу под веткой слева.

Какие листья на ветке справа? Сколько их? Достаньте из конверта нужную цифру и наклейте её внизу под веткой справа.

Каких листьев больше. Наклеивание знака.

№4.Счёт предметов. Наклеивание нужных цифр.

№5. Беседа по сказке. Счёт героев и предметов сказки.

Каких предметов одинаково? Разное количество?

Сколько надо поставить тарелок, чтобы хватило всем медведям?

Достаньте из конверта нужную цифру, наклейте её внизу под картинкой.

Задания по теме: Число и цифра 6.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1.Повторение изученного. Понятия «длиннее», «короче».

Короткую расчёску раскрасьте жёлтым цветом, а длинную- синим.

№2. Повторить понятия « стоит за, после», «стоит перед», «стоит между».

№3.Счёт предметов.

Сколько зайцев? Морковок?

Достаньте из конверта и наклейте снизу нужные цифры.

Чего больше? Как сделать одинаково, столько же?

Зачеркните 1 морковку.

№4. Повторить понятия « стоит за, после», «стоит перед», «стоит между».

Нарисуйте в пустой клетке нужное количество точек.

№5. Получение числа 6.

Сколько флажков на верхней верёвке? А на нижней? Что сделали, чтобы их стало 6?

Знакомство с числом и цифрой 6.

Заучивание стихотворения о цифре 6.

Письмо цифры 6 по точкам.

№6. Закрепление зрительного образа цифр.

Найдите цифру 6 и обведение её в красный кружок.

Сколько у вас кружочков с цифрой 6? (Наклеим нужную цифру).

Найдите цифру 5 и обведение её в зелёный кружок.

Сколько у вас кружочков с цифрой 5? (Наклеим нужную цифру).

Каких цифр больше? (Наклеиваем знак сравнения).

№7. Прямой и обратный счёт.

Понятия « увеличение» и «уменьшение» числа.

1-6;

6-1.

Задания по теме: Число и цифра 6. Закрепление.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1.Порядковый счёт предметов. Назвать их одним словом.

Закрепление понятий: « стоит за, после», «стоит перед», «стоит между».

№2. Количественный счёт предметов.

Сосчитайте предметы и соедините линией с нужной цифрой.

№3. Закрепление зрительного образа цифр.

Раскрасьте все цифры 6 в зелёный цвет.

Посчитайте, сколько 6?

Раскрасьте красным цветом цифру, обозначающую число зелёных цифр.

№4. Соотнесение числа и цифры. Самостоятельная работа (Диагностика знаний цифр 1-6).

Посчитайте количество предметов на каждой картинке.

Достаньте из конверта нужную цифру и наклейте её под картинкой.

№5. Счёт и сравнение предметов.

Сколько грибочков?

Достаньте из конверта нужную цифру и наклейте её справа от картинки.

Сколько ёлочек?

Достаньте из конверта нужную цифру и наклейте её справа от картинки.

Чего больше? (Ставим знак, читаем запись)

Как сделать одинаково?

№6. Подготовка к решению задач.

Сколько рыбок в аквариуме? Как сделать, чтобы их стало 5?

(Наклеиваем 6- 1 =5, объясняем почему знак «минус», читаем запись)

Сколько мячей лежит в шкафу? Как сделать, чтобы их стало 5?

(Наклеиваем 4+1=5, объясняем почему знак «плюс», читаем запись).

№7. Подготовка к решению задач. Беседа о Новогоднем празднике.

Считаем ёлочные игрушки слева и справа.

Сколько их всего?

Наклеиваем запись 3+3=6.Читаем её.

Раскрасьте ёлочные игрушки так, чтобы 3 были одного цвета и 3- другого.

Задания по теме: Число и цифра 7.

(Задания можно выполнять на двух занятиях)

№1.Получение числа 7.

Сколько бусинок раскрашено?

Как чередуются цвет бусинок?

Какой по цвету будет следующая? Раскрасьте её.

Какая по счёту последняя бусинка?

Как получили число 7?

(Наклеиваем под бусами запись: 6+1=7 Читаем её)

№2. Знакомство с числом и цифрой7.

Заучивание стихотворения о цифре7.

Письмо цифры 7 по точкам.

№3. Закрепление зрительного образа цифры 7.

Найдите цифру 7 и обведение её в круг.

Сколько вы нашли цифр?

№4.Прямой и обратный счёт: 1-7; 7-1.

Понятия « увеличение» и «уменьшение» числа.

№5.Счёт предметов и сравнение чисел 7и 6.

(Наклеиваем справа: 7> 6).

Как сделать одинаково?

(Дорисовываем яблоко, наклеиваем внизу запись:6+1=7).

Как по-другому сделать одинаково?

(Зачёркиваем кружку. Наклеиваем внизу запись:7-1=6).

№6. Соотнесение числа и цифры.-

Помоги черепахе попасть домой.

Раскрасьте каждую черепаху и её домик в одинаковый цвет. Путь черепахи к домику нарисуйте тем же цветом.

Задания

Содержание:

1. Понятия «один» и «много»
2. Цифра 1
3. Онлайн игра «Цифра 1. Помоги машинке собрать груз»
4. Прописи «Цифра 1».

Понятия «один и много».

Посмотри на картинки и скажи, что на них изображено:

В мире чего-то может быть много, а что-то — одно. Например, Солнце — одно , луна — одна , а звёзд — много . У дерева ствол — один , а веток и листьев — много . Много яблок на яблоне:

На голове волос много, а нос один, и рот один. Подумай, чего ещё много, а что одно.

В математике понятие «один» , а также «одна», «одно» обозначается цифрой 1 . У цифры 1 есть и другое имя — единица .

Цифра 1.

Запомни, как выглядит цифра 1 . Обведи её пальчиком. Начинай обводить с «носика» (на горочку и вниз). Слепи цифру 1 из пластилина. На что она похожа?

С хитрым носиком сестрица
Счёт откроет
…Единица

Давай проверим, хорошо ли ты запомнил, как выглядит единица. Поиграем в игру. В этой игре нужно помочь машинке собрать груз. Перетащи все коробки с цифрой 1 на белую полоску!

Цифра 1. Онлайн игра

А теперь давай потренируемся писать цифру 1 . Мы нарисовали для тебя целых три прописи.

Прописи с цифрой 1.

Начни обводить с крупных прописей (оранжевых), затем можно обводить наклонные (синие) прописи. А если тебе скоро в школу, учись писать цифру 1 на листе в клеточку (зелёная пропись). Все можно скачать с нашего сайта одним архивом по ссылке внизу.

Крупные прописи для малышей «Цифра 1».

Для знакомства вашего малыша с числом и цифрой «1».

Я уже обращала ваше внимание, что сначала мы знакомим ребенка с числом , а потом уже с цифрой.

Объясните ребенку, что цифра это значок, которым на письме обозначается число.

Как же знакомить с числом «1»?

Например, как показано на моей картинке.

Спросите малыша:

• Где изображено много волчков? (в круге)
• Сколько волчков в треугольнике? (один)

Покажите цифру один или предложите в магнитных цифрах найти цифру один, если ребенок затрудняется, помогите ему.

При знакомстве с цифрами, так же как и с буквами , для лучшего запоминания, начертания цифры предложите ребенку вылепить, или выложить из чего-нибудь цифру один.

Я вам показала один из вариантов, как познакомить малыша с числом и цифрой «1».

При знакомстве с цифрами и числами используйте художественное слово и другой дидактический материал по математике.

Дидактический материал по математике. Цифра «1»

Веселые стихи

Первая цифра

Загадки

На одной ноге стоит,В воду пристально глядит.Тычет клювом наугад – Ищет в речке лягушат. (Цапля.)	Однорукий великанПоднял руку к облакам.Он работник очень важный, Строит дом многоэтажный. (Подъемный кран.)
Я однорукая старуха,Я прыгаю по полотну,И нитку длинную из уха, Как паутину я тяну. (Иголка.) Одна подружка Полезла другой в ушко. (Иголка с ниткой.) В лесу темно. Все спят давно. Одна птица не спит, На суку сидит, Мышей сторожит. (Сова.) Много рук, а нога одна. (Дерево.)		Стоит АнтошкаНа одной ножке.Где солнце станет, Туда он и глянет. (Подсолнух.) Танцует крошка, А всего одна ножка. (Юла.) Зимой и летом – Одним цветом. (Ель.) Плотник острым долотом Строит дом с одним окном. (Дятел.)

Пословицы и поговорки

• Один в поле не воин.
• Один за всех и все за одного.
• Лучше один раз увидеть, чем 100 раз услышать.
• Один старый друг лучше новых двух.

Считалка

Шла кукушка мимо сети,

А за нею малы дети:

Все кричали: – Ку-ку-мак!

Убирай один кулак!

Физминутки

Ребус

Первая цифра сидит в середине,

Буква сначала и буква с конца.

В целом – леса, города и равнины.

К целому полны любовью сердца.

Р 1 А

Программное содержание:

Познакомить детей с цифрой 1, учить соотносить цифру с количеством предметов.
Закреплять умение определять пространственное расположение и копировать его.
Закрепить навыки счета, сравнения предметов по величине.
Учить понимать учебную задачу и выполнять ее самостоятельно.
Закрепит приемы лепки: раскатывание, прижимание, оттягивание.
Развивать мышление, мелкую моторику

Оборудование:

Демонстрационный материал: цифра «1», предметные картинки, наборное полотно или магнитная доска.
Раздаточный материал: тетради или листы бумаги, ручки, кассы цифр или веера «цифры», по три кирпичика каждому ребенку из набора строительного материала, цветные карандаши, листы картона, пластилин.

Ход занятия:

Эта цифра – единица.
Видишь, как она гордится.
А ты знаешь, почему?
Начинает счет всему.
(И. Блюмкин)

Единица или цифра один всегда впереди, она начинает счет.
Найдите цифру один и покажите ее (дети используют кассы цифр или веера «цифры».)

Дидактическое упражнение «Обведи и раскрась цифру»

Дети обводят цифру ручкой и закрашивают ее цветным карандашом.

Дидактическое упражнение «Покажи один предмет»

На местах:
Покажите один палец.
Покажите один карандаш.
Покажите один кирпичик.
У доски или мольберта:
Покажи один кубик, одну книгу, одну куклу, один мяч (картинки).

Дидактическое упражнение «Соедини линией»

Дети предлагается соединить линией круг с цифрой один и круги. В которых нарисован один предмет. Детям задаются вопросы: «А почему ты не соединил с цифрой один вот эту картинку? Сколько предметов изображено на этой картинке?»

Динамическая пауза «Солдатики»

На одной ноге постой-ка,
Будто ты солдатик стойкий.
Ногу левую – к груди,
Да смотри – не упади …
А теперь постой на правой,
Если ты солдатик бравый.
А теперь постой на левой,
Если ты солдатик смелый.
Раз – подняться, потянуться.
Два – согнуться, разогнуться.
Три – в ладоши три хлопка,
Головою три кивка.
На четыре – руки шире.
Пять – руками помахать.
Шесть – на место тихо сесть.

Дидактическая игра «Повторялки»

Воспитатель выкладывает на столе три бруска в разных положениях, после команды «повторяйте» дети выкладывают свои бруски точно по образцу. Воспитатель усложняет задания и сокращает время, отведенное для выполнения задания.

Дидактическое упражнение «Геометрические фигуры»

Вот фигуры – непоседы,
Любят в прятки поиграть.
Так давайте ж их, ребята,
Будем глазками искать.

Влево, вправо посмотрите,
Поищите? Где же круг?
И тебя мы отыскали.
Вот он где, любимый друг.

Дружно глянем все налево.
Что там? Где же там квадрат
Не уйти тебе проказник,
От пытливых глаз ребят.

Вниз глазами поведем,
Треугольник там найдем.
Это – треугольник.
А где – прямоугольник?

Посмотрите в тетради и найдите в них эти фигуры.
Сколько фигур всего?
Какая фигура первая?
Раскрасьте квадрат желтым цветом.
Какая фигура следующая? Какая она по счету? Вторая.
Раскрасьте круг красным цветом.
Какая фигура следующая? Какая она по счету? Третья.
Раскрасьте треугольник синим цветом.
Какая фигура следующая? Какая она по счету? Четвертая.
Раскрасьте прямоугольник любым цветом на свой вкус.

Разминка для пальчиков «Пальчики-детки»

(Л. Мухоморина)

Мама отпустила деток погулять
(раскрыть ладонь, выпрямить все пальцы),
Их у мамы много. Деток этих пять!
Погуляли, детки? А теперь домой!
Приходи скорее, пальчик ты большой
(дети загибают поочередно все пальцы),
А теперь внимательный, пальчик указательный,
А теперь и средний. Это – не последний.
Безымянный пальчик, к дому ты беги
И мизинца-братика с собою прихвати!

Лепка «Единица»

Дети раскатывают из пластилина длинный жгутик, прикладывают и придавливают к листу картона, затем пальцем оттягивают вниз и в сторону «носик» единицы.

Обо всём на свете:

В 1930 году в американский прокат вышел фильм “Песня мошенника” (The Rogue Song) про похищение девушки в горах Кавказа. Актеры Стэн Лорел, Лоуренс Тиббетт и Оливер Харди сыграли в этом фильме местных жуликов. Удивительно, но эти актеры очень похожи на героев…

Материалы раздела

Занятия для младшей группы:

Занятия для средней группы.

Количественная оценка числа копий лентивирусного вектора в отдельных гемопоэтических колониеобразующих клетках показывает дозозависимое влияние вектора на частоту и уровень трансдукции

Создание контролируемых линий клеток человека для измерения интеграции вектора rHIV

Трансдуцированные клетки человека, содержащие известное количество Интеграция rHIV может служить контрольным материалом для анализа VCN в клетках. Панель таких контрольных клеток была создана путем инфицирования клеточной линии фибросаркомы человека HT1080 GFP-LV с последующим отбором и характеристикой стабильно трансдуцированных одноклеточных клонов с переменным количеством VCN.Клетки HT1080 использовались из-за их быстрого роста и небольшого количества хромосомных изменений из-за диплоидного кариотипа (http://www.lgcstandards-atcc.org/ и ссылка 15). После трансдукции вектором и двух раундов клонирования отдельных клеток сначала был выбран и проанализирован единственный клон клетки HT1080 HT4-A. Сайты вставки вектора определяли с помощью метода анализа тегов интеграции вектора (VITA), описанного в другом месте ¹⁶ , показывающего вставку одного вектора в хромосому 19 (таблица 1). Впоследствии этот клон повторно инфицировали GFP-LV, и два дочерних клона, демонстрирующих разные уровни экспрессии GFP, были отобраны путем клонирования одной клетки.Эти клетки HT4-A2 и HT4-A6 показали, соответственно, три и восемь вставок вектора в различных местоположениях генома, включая начальную вставку в хромосому 19. Число сайтов вставки вектора в HT4-A, HT4A-2 и HT4-A6 был подтвержден саузерн-блоттингом с использованием единственного рестрикционного фермента ( Xba I), чтобы выявить картину полос интеграции LV. Как показано на рисунке 1a, мы наблюдали одну полосу в клоне HT4-A, три полосы в HT4-A2 и восемь полос в клоне HT4-A6. При небольшом чрезмерном экспонировании блота появляется очень слабая полоса около 8 т.п.н. во всех клонах HT4 и соответствует неспецифической гибридизации в жестких условиях, использованных в эксперименте.

Таблица 1 Характеристика векторных копий и сайтов вставки вектора в клоны HT1080 Рисунок 1

Характеристика клонов HT4-A, HT4-A2 и HT4-A6. ( a ) Саузерн-блоттинг на Xba I-расщепленной геномной ДНК из клонов HT1080. Полосы зондов представляют собой фрагменты Xba I, высвобождаемые из внутренней области в вектор и фланкирующую геномную ДНК. ( b ) Корреляция между VCN, полученным с помощью Q-PCR, и MFI, полученным с помощью проточной цитометрии в трех клонах.

В предыдущих исследованиях мы использовали дуплексную Q-ПЦР для сравнительной амплификации вектор-специфичных последовательностей (посттранскрипционный регуляторный элемент вируса иммунодефицита человека или гепатита сурков) с клеточным геном человека (ген человеческого альбумина ( ALB ) для которых две копии присутствуют на клетку), чтобы определить количество вставок вектора rHIV в человеческие клетки. ¹² Реакцию калибруют по стандартной кривой, построенной путем серийных разведений плазмиды, несущей единственную копию вектора, несущего WPRE, и последовательность ALB (см. Дополнительную таблицу S1).Анализ геномной ДНК из клонов клеток HT4-A, HT4-A2 и HT4-A6 с помощью такого протокола Q-PCR определил 1,1 ± 0,2, 2,8 ± 0,7 и 7,1 ± 1,3 VCN в повторных экспериментах (таблица 1). Эти результаты согласуются с определением вставок вектора с помощью VITA и саузерн-блоттинга в каждом из клонов. Количество векторных копий также сильно коррелировало с экспрессией интегрированного трансгена GFP в различных клонах клеток, что определялось средней интенсивностью флуоресценции клеток при проточной цитометрии (рис. 1b).

Такие совпадающие результаты VITA, саузерн-блоттинга, Q-PCR и проточной цитометрии характеризуют эти три клеточные линии, которые можно использовать в аналитических целях в качестве панели контрольных клеток, несущих известный диапазон интеграций вектора rHIV.

Проверка метода Q-ПЦР для определения VCN в гемопоэтических клетках-предшественниках

Гематопоэтические клетки-предшественники наделены достаточным потенциалом пролиферации, так что отдельные клетки-предшественники могут образовывать видимые колонии при культивировании в полутвердой среде в присутствии цитокинов.Следовательно, трансдукцию гемопоэтических клеток-предшественников можно оценить на клональном уровне путем измерения VCN в одной единице CFC, в которой все клетки происходят из одной клетки-предшественника. Это побудило нас оценить, можно ли использовать метод дуплексной Q-PCR, который мы использовали ранее, для количественной оценки VCN в CFC. Одна техническая проблема заключается в том, что CFC содержат небольшое количество клеток (от 1000 до 10 000 клеток), что требует особого метода выделения ДНК, что требует оценки чувствительности, осуществимости и надежности этого подхода.

Во-первых, мы определили, будет ли чувствительность нашего протокола Q-PCR адекватной в этом желаемом диапазоне количества клеток. Серийные разведения плазмиды стандартной кривой показали ожидаемую амплификацию ВИЧ по сравнению с последовательностями ALB или WPRE по сравнению с последовательностями ALB всего с 10 ² копий плазмиды, что соответствует 8,26 × 10 ^-7 нг ДНК на реакцию (см. Дополнительную таблицу S1. ). Амплификация последовательностей ВИЧ или WPRE считалась эквивалентной. Учитывая размер плазмиды по отношению к размеру генома человека и количеству ДНК на клетку, этот уровень будет совместим с амплификацией интегрированной ДНК провирусного вектора примерно в 100 клетках.Таким образом, чувствительность Q-PCR в принципе адекватна для анализа CFC.

Во-вторых, мы определили, можем ли мы амплифицировать небольшие количества материала клеточной геномной ДНК в условиях, совместимых с изучением CFC. Экстракцию геномной ДНК из CFC выполняли одностадийным лизисом протеиназы K, который, как сообщается, успешен с небольшим количеством клеток. ¹⁷ Проверяли влияние количества клеток и условий экстракции. Геномную ДНК получали из уменьшающегося числа клеток HT4-A, HT4-A2 и HT4-A6 после экстракции протеиназой K в присутствии или без метилцеллюлозы.Как показано на рисунке 2a, порог цикла (CT) для последовательности ALB увеличивался соответственно уменьшению размера выборки клеток. Наименьшее количество геномной ДНК, которое могло обеспечить интерпретируемый сигнал с CT 31,2 ± 0,5 ( n = 94), соответствовало 100 клеткам, что подтверждает диапазон предсказанной чувствительности Q-PCR. Определение VCN из различных количеств геномной ДНК, полученной от каждого из клонов, показало аналогичные значения в диапазоне протестированных эквивалентных клеток (рис. 2b).Однако более низкие значения VCN, чем ожидалось, были получены при амплификации с помощью Q-PCR небольших количеств геномной ДНК, экстрагированной протеиназой K из клеток HT4-A, HT4-A2 и HT4-A6 (рис. 2b). В этих условиях количество копий было ниже ожидаемого примерно на 30–40%. При шести разведениях клеток, показанных на рисунке 2b, клон HT4-A дал в среднем 0,7 ± 0,1 VCN (диапазон 0,6–0,8), что на 30% меньше ожидаемого значения 1; HT4-A2 дал в среднем 1,7 ± 0,4 VCN (диапазон 1,3–2,5), что на 40% меньше ожидаемого значения 3; и HT4-A6 дали в среднем 5.7 ± 0,5 VCN (диапазон 5–6,4), что на 30% меньше ожидаемого значения 8. Чтобы понять причину такой субоптимальной точности, мы исследовали несколько параметров. Число копий, измеренное для геномной ДНК, полученной из большого количества клеток с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК, было близко к ожидаемым значениям (VCN 0,97, 3,12 и 7,1 для каждого из трех клонов) (контроли на рис. 2b в правой части графика), демонстрируя точность самого этапа амплификации Q-PCR, когда он выполняется на оптимальном материале.Поэтому было исследовано качество геномной ДНК. Было обнаружено, что метод экстракции протеиназы К дает более низкие значения VCN, чем коммерческий набор для экстракции ДНК, даже при большом количестве клеток, хотя эта более низкая тенденция не была обнаружена статистически значимой (рис. 2c). Присутствие или отсутствие метилцеллюлозы в клетках не оказало значительного влияния на значения VCN в клонах (рис. 2d). Таким образом, этап экстракции геномной ДНК сам по себе является критическим параметром для точности определения VCN в CFC с помощью Q-PCR.Таким образом, преимущество быстрой одностадийной процедуры протеиназы К должно быть смягчено недооценкой значений VCN на 30-40%. Однако с определением этого ограничения подход остается полезным и обеспечивает дозозависимые результаты для оценки распределения VCN на клональном уровне.

Рисунок 2

Определение VCN с помощью Q-PCR. ( a ) Чувствительность Q-PCR оценивали путем измерения значений CT (среднего из повторяющихся измерений) для амплификации последовательностей гена альбумина при уменьшении количества контрольных клеток.Q-ПЦР проводилась с 1/6 всей геномной ДНК, выделенной из 500–50 000 клеток. ( b ) VCN в клонах HT4-A, HT4-A2 и HT4-A6 измеряли после лизиса протеиназы K отдельных препаратов клеток в диапазоне от 500 до 50 000 клеток на условие. Q-PCR была проведена на 1/6 экстрагированной геномной ДНК, как показано на рисунке 2a. Контроль, указанный в правой части графика, соответствует Q-ПЦР на геномной ДНК, полученной из 1 × 10 ⁶ клеток, экстрагированных с помощью коммерческого набора Promega.( c ) Сравнение значений VCN, полученных на трех клонах с использованием геномной ДНК, экстрагированной либо лизисом протеиназы K из числа клеток, меньших 5 × 10 ⁴ , либо с использованием коммерческого набора и 1 × 10 ⁶ клеток на добыча. ( d ) Сравнение значений VCN, полученных с помощью Q-PCR из трех клонов с использованием геномной ДНК, экстрагированной лизисом протеиназы K в присутствии (5 мкл на условие) или в отсутствие метилцеллюлозы.

В-третьих, мы использовали этот метод Q-PCR для оценки трансдукции CD34 + гематопоэтических клеток-предшественников пуповинной крови с различными концентрациями GFP-LV путем сравнения количества копий вектора по отношению к экспрессии трансгена в отдельных CFC.Инфицированные клетки CD34 + высевали в метилцеллюлозу, и через 2 недели колонии оценивали под эпифлуоресцентной микроскопией для определения экспрессии GFP. Геномную ДНК экстрагировали из каждой колонии с помощью протеиназы К для измерения копий вектора с помощью дуплексной Q-PCR. Колонии считались положительными для вектора, когда они отображали определенный сигнал, даже если значения VCN могли быть ниже одной копии на ячейку (значение отсечения 0,1). В этих условиях положительная корреляция ( r ² = 0.92; n = 13) было обнаружено между частотой CFC, экспрессирующей белок GFP, и положительной оценкой вектора с помощью Q-PCR (рис. 3). Только 4-7% CFC были признаны положительными при микроскопии, не имевших детектируемой векторной интеграции при кПЦР, и, наоборот, только 6 ± 5% CFC получили отрицательные результаты при микроскопии, которые дали положительный сигнал при кПЦР.

Рисунок 3

Корреляция между GFP-положительным CFC, наблюдаемым под микроскопом, и вектор-положительным CFC, оцененным с помощью Q-PCR ( n = 13 экспериментов).

Было предложено, что вероятность трансдукции отдельных гемопоэтических клеток в препарате может быть оценена по средней средней скорости трансдукции с использованием анализа распределения Пуассона. ¹⁸ Предполагая, что каждая клетка имеет эквивалентную вероятность трансдукции и что распределение событий не изменяется культурой клеток, тогда скорость трансдукции может предсказать процент клеток, получающих по крайней мере одну копию вектора. Скорость трансдукции можно оценить по среднему числу копий на клетку во всей популяции клеток.В серии экспериментов клетки CD34 + были инфицированы GFP-LV в количестве 2 × 10 ⁸ IG на мл, давая среднее значение VCN 1,4 ± 0,4 во всей популяции ( n = 3 эксперимента) и в этом наборе В экспериментах присутствие вектора измеряли с помощью Q-PCR на CFC (таблица 2 и рисунок 5a). Это показало 70% вектор-положительных индивидуальных CFC (Таблица 2 и Рисунок 5a), что близко к ожидаемой эффективности трансдукции 65%, рассчитанной из распределения Пуассона согласно Ref. 18. Аналогичные результаты были сделаны с другим вектором.В шести независимых трансдукциях клеток CD34 + вектором WASP-LV мы измерили среднее значение 0,4 ± 0,1 копий вектора на клетку в культивируемой популяции целых клеток (данные не показаны). В одном из этих шести экспериментов частота трансдукции CFC составила 40% с помощью Q-PCR (таблица 2), что также очень близко к ожидаемой частоте трансдукции 35% на основе распределения Пуассона.

Таблица 2 Влияние концентрации вектора на трансдукцию CFC

В целом эти результаты экспериментально подтверждают возможность использования Q-PCR для количественной оценки частоты трансдукции в одиночном CFC.

Применение Q-PCR на CFC для оценки влияния концентрации вектора и количества совпадений на трансдукцию гемопоэтических клеток-предшественников

Можно адаптировать различные параметры, такие как концентрация вектора и количество совпадений вектора для оптимизации инфицирования гемопоэтических клеток-предшественников LV. Повышение концентрации GFP-LV увеличивало процент экспрессирующих GFP клеток в основной популяции культивируемых клеток CD34 +, как ожидалось ¹⁹ , и увеличивало среднее значение VCN в популяции (рис. 4a), таким образом, приводя к хорошей корреляции между экспрессия трансгена и трансдукция клеток (рис. 4b).На уровне отдельных клеток-предшественников увеличение концентрации LV увеличивало частоту трансдуцированных CFC (Таблица 2 и Рисунок 5a). Кроме того, это также изменило распределение VCN в популяции клеток-предшественников, о чем свидетельствуют увеличенные медианные значения или диапазон VCN при использовании более высоких концентраций вектора (таблица 2). Частота CFC, содержащих более двух векторных копий на ячейку, также была увеличена, как представлено категориями частоты в соответствии с VCN на рисунке 5a. Тем не менее, в тестируемых условиях большинство трансдуцированных CFC интегрировали только одну копию вектора на клетку.

Рисунок 4

( a ) Трансдукция клеток CD34 + с увеличивающимися концентрациями GFP-LV, протестированных от 0,1 до 10 × 10 ⁷ IG мл ^-1 в восьми независимых экспериментах. Результаты показывают среднее значение VCN, определенное на клетках, размноженных в жидкой культуре в присутствии цитокинов, в течение 2 недель после экстракции набора геномной ДНК (среднее ± стандартное отклонение). ( b ) Корреляция между средним значением VCN и частотой экспрессии GFP, измеренной с помощью FACS в 40 экспериментах, в которых были протестированы различные концентрации вектора GFP-LV.

Рисунок 5

Влияние экспериментальных условий на частоту трансдукции и на распределение копий вектора в популяции. CFC со значениями VCN от 0 до 0,1 были отнесены к категории 0; те, которые содержали от 0,1 до 1,1, были отнесены к категории 1; те, которые содержали от 1,2 до 2,1, были отнесены к категории 2, а те, у которых VCN выше 2,1, были отнесены к категории> 2. Столбцы представляют собой средний процент CFC в каждой категории от общего количества проанализированных CFC.Количество проанализированных CFC указано в скобках для каждого графика. ( a ) Трансдукция ультрацентрифугированным GFP-LV с использованием различных концентраций вектора. Результаты представляют собой объединенные данные трех отдельных экспериментов по трансдукции. ( b ) Трансдукция ультрацентрифугированным WASP-LV с использованием нескольких концентраций векторов и одного или двух последовательных инфекций (попаданий). Результаты представляют собой объединенные данные двух отдельных экспериментов по трансдукции. ( c ) Трансдукция с помощью GFP-LV в концентрации 2 × 10 ⁸ IG мл ^-1 , введенной один или два раза.Результаты представляют собой объединенные данные двух отдельных экспериментов по трансдукции. ( d ) Трансдукция двумя партиями хроматографически очищенного WASP-LV с использованием двух концентраций. Данные одного эксперимента.

Было проанализировано влияние нескольких раундов инфекции на трансдукцию CFC. Клетки CD34 + инфицировали один раз в течение 6 часов или дважды последовательно, добавляя вектор той же концентрации во второй раз. Второй удар заражения GFP-LV мало повлиял на частоту вектор-положительных CFC, как показано в таблице 3, но вместо этого он сдвинул медианное значение VCN с 1.4 к 2.2. Этот эффект также проиллюстрирован на рисунке 5c, где более высокий процент CFC обнаружен в категориях ячеек с VCN, равным двум или превосходящим их. Диапазон VCN, полученного после заражения GPF-LV, очень широк, даже при одном попадании. Напротив, выполнение второго удара с WASP-LV увеличило частоту преобразованного CFC, но не изменило медианное значение или диапазон значений VCN (Таблица 3). Однако это увеличило процент CFC с двумя копиями вектора (рис. 5b) без значительного влияния на более высокие категории.Таким образом, эти результаты показывают, что разные типы LV могут вести себя по-разному в зависимости от условий эксперимента. С помощью WAS-LV, протестированного здесь, эффективность трансдукции может быть более эффективно увеличена двумя последовательными попаданиями вектора, а не удвоением концентрации вектора.

Таблица 3 Влияние повторной инфекции на трансдукцию CFC

Применение Q-PCR на CFC для оценки активности очищенного WASP-LV

В перспективе клинических исследований генной терапии для WAS мы разработали крупномасштабный процесс очистки WASP-LV с использованием хроматографии и мембран. ²⁰ Препараты очищенного хроматографией WASP-LV были получены на этой стадии разработки и о них сообщалось ранее. ²¹ Две партии очищенного хроматографией WASP-LV были протестированы здесь для определения способности трансдуцировать отдельные CFC по сравнению с тем же вектором, сконцентрированным с помощью ультрацентрифугирования. Сравнимые уровни трансдукции были обнаружены между этими двумя типами препаратов, как показано в таблице 2. Приблизительно 40-50% CFC трансдуцировались очищенным хроматографически вектором по сравнению с примерно 30% ультрацентрифугированным вектором, но медиана VCN была немного выше в последнем (0.9–1,1), чем первый (0,5–0,7). Приблизительно 90% CFC, которые были преобразованы с помощью очищенного хроматографией WASP-LV, имели менее двух векторных копий на клетку, как показано на рисунке 5d (при обеих проверенных концентрациях 3% CFC имели> 2 VCN и 7-8% имели два VCN). Таким образом, в отличие от того, что наблюдалось с GFP-LV, увеличение концентрации WASP-LV улучшало частоту трансдукции, но мало влияло на увеличение VCN на клетку. Это предполагает, что плато трансдукции, вероятно, было достигнуто с наивысшим значением 10 ⁸ IG на мл этого препарата LV.Не исключающим друг друга способом это также предполагает, что разные препараты LV могут иметь разные свойства инфекционности для гематопоэтических клеток-предшественников.

Трансдукция субпопуляций гемопоэтических клеток

Для оценки трансдукции различных типов гемопоэтических клеток-предшественников мы исследовали влияние GFP-LV и WASP-LV на значения VCN в каждом типе гемопоэтических колоний, комбинируя все экспериментальные условия. протестировано для каждого вектора. Это показало, что VCN находились в аналогичном диапазоне в колониеобразующих единицах (КОЕ) – гранулоцитах, моноцитах (GM) и КОЕ-гранулоцитах, эритроцитах, моноцитах, мегакариоцитах (GEMM) в колониях и в большинстве своем уступали четырем копиям на клетку, как 83 % CFC были преобразованы с помощью GFP-LV (Рисунок 6a), а 96% CFC были преобразованы с помощью WASP-LV (Рисунок 6b).Однако также следует отметить, что и GFP, и WASP LV генерируют более высокие значения VCN в эритроидных колониях (колониеобразующая единица, эритроид (CFU-E) / взрывообразующая единица, эритоид (BFU-E)), чем в миелоидных и / или смешанные колонии (CFU-GEMM). Разница между значениями VCN в эритроидных колониях по сравнению с другими категориями по отдельности или вместе, является статистически значимой ( P <0,05, критерий Стьюдента t ).

Рисунок 6

Распределение VCN в различных типах CFC (CFU-GM, CFU-mix и BFU-E) из клеток CD34 +, трансдуцированных ( a ) GFP-LV или ( b ) посредством WASP-LV.

Вариабельность количества копий сильно коррелирует с дифференциальной экспрессией генов: пан-раковое исследование | BMC Medical Genetics

1.

Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH, Andrews TD, et al. Глобальные вариации числа копий в геноме человека. Природа. 2006; 444: 444–54.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

2.

Sachidanandam R, Weissman D, Schmidt SC, Kakol JM, Stein LD, Marth G, et al.Карта вариаций последовательности генома человека, содержащая 1,42 миллиона однонуклеотидных полиморфизмов. Природа. 2001; 409: 928–33.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

3.

Международный HapMap C. Международный проект HapMap. Природа. 2003. 426: 789–96.

Артикул CAS Google ученый

4.

Яфрат А.Дж., Феук Л., Ривера М.Н., Листевник М.Л., Донахью П.К., Ци И и др.Обнаружение крупномасштабных вариаций в геноме человека. Нат Жене. 2004; 36: 949–51.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

5.

Себат Дж., Лакшми Б., Троге Дж., Александр Дж., Янг Дж., Лундин П. и др. Полиморфизм крупномасштабного числа копий в геноме человека. Наука. 2004; 305: 525–8.

CAS PubMed Статья Google ученый

6.

Tuzun E, Sharp AJ, Bailey JA, Kaul R, Morrison VA, Pertz LM, et al. Мелкомасштабные структурные вариации генома человека. Нат Жене. 2005; 37: 727–32.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

7.

Конрад Д.Ф., Эндрюс Т.Д., Картер Н.П., Херлс М.Э., Притчард Дж. Обзор делеционного полиморфизма в геноме человека с высоким разрешением. Нат Жене. 2006; 38: 75–81.

CAS PubMed Статья Google ученый

8.

Хайндс Д.А., Клок А.П., Джен М., Чен Икс, Фрейзер К.А. Обычные делеции и SNP находятся в неравновесном сцеплении в геноме человека. Нат Жене. 2006; 38: 82–5.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

9.

Ян Л., Ван Ю.З., Чжу ХХ. Chang Y. Li LD: Chen WM, et al. Вариация числа копий гена PRAME связана с его экспрессией при множественной миеломе. ДНК Cell Biol; 2017.

Google ученый

10.

Zhou C, Zhang W, Chen W., Yin Y, Atyah M, Liu S и др. Комплексный анализ вариаций числа копий и профилей экспрессии генов при гепатоцеллюлярной карциноме. Научный доклад 2017; 7: 10570.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

11.

Хуанг Ю.С., Лю В.Б., Хань Ф., Ян Дж.Т., Хао Х.Л., Чен HQ и др. Вариации числа копий и экспрессия MPDZ являются прогностическими биомаркерами светлоклеточного почечно-клеточного рака.Oncotarget. 2017; 8: 78713–25.

PubMed PubMed Central Google ученый

12.

Gut A, Moch H, Choschzick M. Амплификация и сверхэкспрессия гена SOX2 связаны с HPV-положительными карциномами вульвы. Int J Gynecol Pathol. 2017; 37: 68–73.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

13.

Самулин Эрдем Дж., Арнольдуссен Ю. Дж., Скауг В., Хауген А., Зиенолддини С.Вариация числа копий, повышенная экспрессия генов и молекулярные механизмы нейрофасцина при раке легких. Mol Carcinog. 2017; 56: 2076–85.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

14.

Kuzyk A, Booth S, Righolt C, Mathur S, Gartner J, Mai S. Сверхэкспрессия MYCN связана с несбалансированным увеличением числа копий, измененным ядерным расположением и сверхэкспрессией генов 17q плеча хромосомы в опухолях и клетках нейробластомы. линий.Гены Хромосомы Рак. 2015; 54: 616–28.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

15.

Ши Дж, Цюй И, Ли Х, Суй Ф, Яо Д., Ян Кью и др. Повышенная экспрессия EHF посредством амплификации гена способствует активации передачи сигналов семейства HER и связана с плохой выживаемостью при раке желудка. Cell Death Dis. 2016; 7: e2442.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

16.

Dong G, Mao Q, Yu D, Zhang Y, Qiu M, Dong G, et al. Интегративный анализ числа копий и профилей транскрипционной экспрессии при раке пищевода для определения нового гена-драйвера для терапии. Научный отчет 2017; 7: 42060.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

17.

Budczies J, Bockmayr M, Denkert C, Klauschen F, Groschel S, Darb-Esfahani S, et al. Пан-рак анализ изменений числа копий лиганда запрограммированной смерти 1 (PD-L1, CD274) – ассоциации с экспрессией генов, мутационной нагрузкой и выживаемостью.Гены Хромосомы Рак. 2016; 55: 626–39.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

18.

Квак Й., Нам С.К., Сео А.Н., Ким Д.В., Кан С.Б., Ким У.С. и др. Число копий гена рецептора 1 фактора роста фибробластов и экспрессия мРНК при первичном колоректальном раке и его клинико-патологическая корреляция. Патобиология. 2015; 82: 76–83.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

19.

Zhao N, Wilkerson MD, Shah U, Yin X, Wang A, Hayward MC и др. Изменения LKB1 и KRAS и риск метастазирования в мозг: всесторонняя характеристика с помощью анализа мутаций, количества копий и экспрессии генов в немелкоклеточной карциноме легкого. Рак легких. 2014; 86: 255–61.

PubMed PubMed Central Статья Google ученый

20.

Чжао М., Чжао З. Согласованность потери числа копий и подавления генов-супрессоров опухоли: исследование пан-рака.BMC Genomics. 2016; 17 (Приложение 7): 532.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

21.

Мермель С.Х., Шумахер С.Е., Хилл Б., Мейерсон М.Л., Бероухим Р., Гетц Г. GISTIC2.0 обеспечивает чувствительную и надежную локализацию мишеней фокального соматического изменения числа копий при раке человека. Genome Biol. 2011; 12: R41.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

22.

Li B, Dewey CN. RSEM: точная количественная оценка транскриптов на основе данных RNA-Seq с референсным геномом или без него. BMC Bioinformatics. 2011; 12: 323.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

23.

Гринман С.Д., Бигнелл Г., Батлер А., Эдкинс С., Хинтон Дж., Беар Д. и др. PICNIC: алгоритм для прогнозирования абсолютной вариации числа аллельных копий с помощью микроматричных данных рака. Биостатистика. 2010; 11: 164–75.

PubMed Статья Google ученый

24.

Консорциум GT, Лаборатория DA, Координационный центр – аналитическая рабочая группа G, группы статистических методов – аналитическая рабочая группа G, Enhancing Gg, фонд NIHC и др. Генетические эффекты на экспрессию генов в тканях человека. Природа. 2017; 550: 204–13.

Артикул Google ученый

25.

Хуанг да В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А.Инструменты обогащения биоинформатики: пути к всестороннему функциональному анализу больших списков генов. Nucleic Acids Res. 2009; 37: 1–13.

PubMed Статья CAS Google ученый

26.

Tan X, He X, Jiang Z, Wang X, Ma L, Liu L, et al. Дерлин-1 сверхэкспрессируется при раке толстой кишки человека и способствует пролиферации раковых клеток. Mol Cell Biochem. 2015; 408: 205–13.

CAS PubMed Статья Google ученый

27.

Dong Q, Fu L, Zhao Y, Tan S, Wang E. Сверхэкспрессия Derlin-1 дает плохой прогноз при мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря и способствует химиорезистентности и инвазии через передачу сигналов PI3K / AKT и ERK / MMP. Oncotarget. 2017; 8: 17059–69.

PubMed PubMed Central Google ученый

28.

Грегори С.Г., Барлоу К.Ф., Маклей К.Э., Каул Р., Сварбрек Д., Данхэм А. и др. Последовательность ДНК и биологическая аннотация хромосомы 1 человека.Природа. 2006; 441: 315–21.

CAS PubMed Статья Google ученый

29.

Башир Т., Пагано М. Аберрантный убиквитин-опосредованный протеолиз регуляторных белков клеточного цикла и онкогенез. Adv Cancer Res. 2003. 88: 101–44.

CAS PubMed Google ученый

30.

Kramer N, Schmollerl J, Unger C., Nivarthi H, Rudisch A, Unterleuthner D, et al. Аутокринная передача сигналов WNT2 в фибробластах способствует прогрессированию колоректального рака.Онкоген. 2017; 36: 5460–72.

CAS PubMed Статья Google ученый

31.

Ланг В., Эйлет Ф., Ксолальпа В., Серна С., Секкато Л., Лопес-Рейес Р.Г. и др. Анализ убиквитилирования дефектных белков, связанных с клетками, устойчивыми к адриамицину. Клеточный цикл. 2017; 16: 2337–44.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

32.

Ao N, Chen Q, Liu G.Небольшие молекулы, нацеленные на убиквитин-протеасомную систему для лечения рака. Экран с высокой пропускной способностью Comb Chem. 2017; 20: 403–13.

CAS PubMed Статья Google ученый

33.

Roeten MSF, Cloos J. Jansen G. Cancer Chemother Pharmacol: Позиционирование ингибиторов протеасом в терапии солидных злокачественных новообразований; 2017.

Google ученый

34.

Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, Forslund K, Heller D, Huerta-Cepas J, et al.СТРОКА v10: сети белок-белкового взаимодействия, интегрированные в древо жизни. Nucleic Acids Res. 2015; 43: D447–52.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

35.

Fehrmann RS, Karjalainen JM, Krajewska M, Westra HJ, Maloney D, Simeonov A, et al. Анализ экспрессии генов определяет глобальную чувствительность к дозировке генов при раке. Нат Жене. 2015; 47: 115–25.

CAS PubMed Статья Google ученый

36.

Sousa V, Reis D, Silva M, Alarcao AM, Ladeirinha AF, d’Aguiar MJ, et al. Амплификация гена FGFR1 и экспрессия белка FGFR1 обнаруживаются в различных гистологических типах карциномы легких. Арка Вирхова. 2016; 469: 173–82.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

37.

Jung MJ, Woo CG, Lee S, Chin S, Kim HK, Kwak JJ, et al. Вариация числа копий гена и сверхэкспрессия белков EGFR и HER2 в дистальной внепеченочной холангиокарциноме.Патология. 2017; 49: 582–8.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

38.

Ли MJ, Kim N, Choung HK, Choe JY, Khwarg SI, Kim JE. Повышенное количество копий гена HER2 и избыточная экспрессия конкордантного белка, обнаруженная в подгруппе карциномы сальных желез век, указывают на HER2 как на потенциальную терапевтическую мишень. J Cancer Res Clin Oncol. 2016; 142: 125–33.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

39.

Инь Икс, Чжан Т., Су Икс, Джи И, Йе П, Фу Х и др. Взаимосвязь между увеличением хромосомы 7, увеличением числа копий гена MET и сверхэкспрессией белка MET у пациентов с китайской папиллярной почечно-клеточной карциномой. PLoS One. 2015; 10: e0143468.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

40.

Chien HT, Cheng SD, Chuang WY, Liao CT, Wang HM, Huang SF. Клинические последствия амплификации гена FADD и сверхэкспрессии белка в тайваньских плоскоклеточных карциномах полости рта.PLoS One. 2016; 11: e0164870.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

41.

Eisenberg E, Levanon EY. Гены домашнего хозяйства человека компактны. Тенденции Genet. 2003; 19: 362–5.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

42.

Klopfleisch R, Schutze M, Linzmann H, Brunnberg L, Gruber AD. Повышенная экспрессия Derlin-1 в метастазах аденокарциномы молочной железы собак.J Comp Pathol. 2010. 142: 79–83.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

43.

Dong QZ, Wang Y, Tang ZP, Fu L, Li QC, Wang ED, et al. Derlin-1 сверхэкспрессируется при немелкоклеточном раке легкого и способствует инвазии раковых клеток посредством EGFR-ERK-опосредованной активации MMP-2 и MMP-9. Am J Pathol. 2013; 182: 954–64.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

44.

Лу Х, Е К., Цзоу К., Чен Дж. Идентификация генов, управляемых вариациями числа копий, для рака печени с помощью биоинформатического анализа. Онкол Реп. 2014; 32: 1845–52.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

45.

Ян З., Чжуань Б., Ян Й, Цзян С., Ван Т. Комплексный анализ вариаций числа копий и дифференциальной экспрессии генов в плоскоклеточной карциноме легких. Biol Res. 2015; 48: 47.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

46.

Блюхер С, Штадлер СК. Ожирение и рак груди: текущие сведения о роли жирных кислот и липидного обмена в стимулировании роста и прогрессирования рака груди. Фронт-эндокринол (Лозанна). 2017; 8: 293.

Артикул Google ученый

47.

Иоммарини Л., Гелли А., Гаспар Г., Порчелли А.М. Митохондриальный метаболизм и восприятие энергии при прогрессировании опухоли. Biochim Biophys Acta. 1858; 2017: 582–90.

Google ученый

48.

Лю Кью, Луо Кью, Халим А., Сонг Дж. Нацеливание на липидный метаболизм раковых клеток: многообещающая терапевтическая стратегия для лечения рака. Cancer Lett. 2017; 401: 39–45.

CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

49.

Пурам С.В., Тирош И., Парих А.С., Патель А.П., Ижак К., Гиллеспи С. и др. Одноклеточный транскриптомный анализ экосистем первичных и метастатических опухолей при раке головы и шеи. Клетка. 2017.

50.

Pappas L, Xu XL, Abramson DH, Jhanwar SC. Геномная нестабильность и пути пролиферации / выживания при злокачественных новообразованиях с дефицитом RB1. Adv Biol Regul. 2017; 64: 20–32.

CAS PubMed Статья Google ученый

51.

Ди Фиоре Р., Д’Аннео А., Тесорьер Г., Венто Р. RB1 при раке: различные механизмы инактивации RB1 и изменения пути pRb в онкогенезе. J. Cell Physiol. 2013; 228: 1676–87.

PubMed Статья CAS Google ученый

52.

Ma J, Huang K, Ma Y, Zhou M, Fan S. Ось TAZ-miR-224-SMAD4 способствует онкогенезу при остеосаркоме. Cell Death Dis. 2017; 8: e2539.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

53.

Ахмед С., Брэдшоу А.Д., Гера С., Деван М.З., Сюй Р. Путь передачи сигналов TGF-бета / Smad4 в канцерогенезе поджелудочной железы и его клиническое значение. J Clin Med. 2017; 6: 5.

54.

Taniguchi K, Moroishi T., de Jong PR, Krawczyk M, Grebbin BM, Luo H, et al.Ауторегуляторная петля YAP-IL-6ST, активируемая при потере APC, контролирует онкогенез толстой кишки. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017; 114: 1643–8.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

55.

Дэли С.С., Шоу П., Ордонез Л.Д., Уильямс Г.Т., Квист Дж., Григориадис А. и др. Функциональная избыточность между Apc и Apc2 регулирует гомеостаз ткани и предотвращает онкогенез в эпителии молочных желез мышей. Онкоген. 2017; 36: 1793–803.

CAS PubMed Статья Google ученый

56.

Эль-Хефнави М., Солиман Б., Абу-Шахба Н., Амер М. Интегративный мета-анализ микроРНК в гепатоцеллюлярной карциноме. Геномика Протеомика Биоинформатика. 2013; 11: 354–67.

CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

57.

Луна Коронелл Дж. А., Сержелен К., Хофер П., Гюрджан И. и др.Иммуном рака толстой кишки: функциональный in Silico анализ антигенных белков, полученных на основе профилирования микроматрицы IgG. Геномика Протеомика Биоинформатика. 2018; 16: 73–84.

PubMed PubMed Central Статья Google ученый

58.

Моферс А., Пеллегрини П., Линдер С., Д’Арси П. Деубиквитиназы, ассоциированные с протеасомами, и рак. Cancer Metastasis Rev. 2017.

Механизмы изменения номера копии гена

Nat Rev Genet.Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 4 мая.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC2864001

NIHMSID: NIHMS185157

PJ Hastings

¹ Департамент молекулярной генетики и генетики человека Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

Джеймс Р. Лупски

¹ Департамент молекулярной генетики и генетики человека, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

² Департамент педиатрии Медицинского колледжа Бейлора , One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

⁶ Texas Children’s Hospital

Susan M Rosenberg

¹ Департамент молекулярной генетики и генетики человека, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

³ Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

^{4 9 0006 Кафедра молекулярной вирусологии и микробиологии, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030}

⁵ The Dan L.Онкологический центр Дункана, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

Grzegorz Ira

¹ Кафедра молекулярной генетики и генетики человека, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

¹ Кафедра молекулярной генетики и генетики человека, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

² Кафедра педиатрии, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

³ Департамент Биохимия и молекулярная биология, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

⁴ Кафедра молекулярной вирусологии и микробиологии, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

⁵ The Dan Л.Онкологический центр Дункана, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, Хьюстон, Техас 77030

⁶ Техасская детская больница

^* Для корреспонденции: Филиппа Дж. Хастингса, доктора философии, кафедра молекулярной генетики и генетики человека, Медицинский колледж Бейлора, One Baylor Plaza, T809-B, почтовый терминал: BCM225, Хьюстон, Техас 77030, тел .: (713) 798- 5787

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Rev Genet. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Делеции и дупликации хромосомных сегментов (вариации числа копий или CNV) представляют собой основной источник различий между отдельными людьми, лежащих в основе эволюции человека и многих заболеваний, от психических заболеваний и нарушений развития до рака. CNVs формируются со скоростью, намного превышающей другие виды мутагенеза, и, по-видимому, это происходит с помощью аналогичных механизмов у бактерий, дрожжей и человека. Мы рассматриваем модели механизмов образования CNV. В то время как негомологичные механизмы соединения концов хорошо известны, недавние модели фокусируются на нарушении репликации ДНК и репликации несмежных сегментов ДНК, включая предположение о том, что репарация сломанных репликационных вилок переключается под действием стресса с высокоточной гомологичной рекомбинационной на негомологичную. ремонт, который способствует CNV.

Человеческие популяции демонстрируют обширный полиморфизм в количестве копий хромосомных сегментов и генов, включенных в эти сегменты, состоящих как из добавлений, так и из делеций ^{1 – 5} . Это известно как вариация числа копий (CNV). Большая часть генома, в настоящее время оцениваемая до 12%, подвержена CNV ^{1 – 4 , 6} , которые могут возникать как мейотически, так и соматически, как показывает открытие, что однояйцевые близнецы могут отличаться по CNV ⁷ и что разные органы и ткани различаются по количеству копий у одного и того же человека ⁸ .CNV не менее важен для определения различий между отдельными людьми, чем однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) ⁹ , и, по-видимому, является основной движущей силой эволюции, особенно в быстрой эволюции, которая произошла и продолжает происходить внутри линия происхождения человека и великой обезьяны ^{10 – 14} . Изменения в количестве копий могут изменять уровни экспрессии генов, включенных в области с переменным количеством копий, позволяя уровни транскрипции выше или ниже тех, которые могут быть достигнуты путем контроля транскрипции отдельных копий на гаплоидный геном.Возможные адаптивные преимущества CNV обсуждаются во вставке 1. Однако дополнительные копии генов также обеспечивают избыточность в последовательности, так что некоторые копии могут свободно развивать новые или модифицированные функции или паттерны экспрессии, в то время как другие копии сохраняют исходную функцию ^{15 , 16} . События негомологичной рекомбинации, лежащие в основе изменений числа копий, также позволяют перераспределить экзоны между разными генами путем транслокации, вставки или делеции ^{17 , 18} , так что белки могут приобретать новые домены и, следовательно, новые или модифицированные активности.

Вставка 1 Насколько CNV адаптивен?

Первоначально CNV оказался полезным, потому что включенные гены обогащены генами, связанными с обонянием и иммунитетом к болезням, а также секретируемыми белками, то есть генами, относящимися к ближайшему окружению ¹²⁰ . Сообщалось, что эти гены были отобраны недавно, потому что они содержат более высокую, чем среднюю частоту несинонимичных мутаций ¹²⁰ . Теперь для этих функций предложены альтернативные объяснения ¹³⁸ .Области, где обнаруживаются CNV, могут быть регионами, где количество копий менее важно, чем в других регионах. Другими словами, большая часть CNV быстро удаляется из популяции, но выбор сбалансированного генотипа слабее в регионах, где обнаружены CNV, так что CNV в этих регионах сохраняются дольше. Слабость в очищающем отборе также объясняет наблюдаемую более высокую частоту мутаций, чем в геноме в целом, потому что даже потеря функциональных аллелей в этих областях будет удаляться из популяции очень медленно ¹³⁸ .

Свидетельств того, что меньшее или большее количество копий определенных генов дает избирательное преимущество, немного. Ген амилазы слюны человека, AMY1, обнаруживает CNV в человеческих популяциях ¹³⁹ . Количество амилазы слюны прямо пропорционально количеству копий AMY1. Среднее количество копий AMY1 выше в культурах, потребляющих крахмал, чем у людей в культурах, которые потребляют мало крахмала ¹³⁹ , что позволяет предположить, что высокое количество копий AMY1 является преимуществом в культурах, потребляющих крахмал, и нейтральным в культурах с низким потреблением крахмала ¹³⁹ .Второй возможный пример – корреляция между количеством копий CCL3L1, который кодирует хемокин, и восприимчивостью к ВИЧ / СПИДу ¹⁴⁰ . Пример полезного уменьшения числа копий предложен для α-глобиновых локусов. Недостатки делеции у гомозигот могут быть уравновешены устойчивостью гетерозигот к малярии (обзор ¹⁴¹ ). Будут найдены и другие примеры, но большая часть обширной CNV у человека кажется неадаптивной или невыгодной и присутствует только потому, что она еще не очищена.Около 75% CNV обнаруживается с частотой менее 3% в человеческих популяциях ³ , что свидетельствует о стохастическом происхождении и сохранении большинства CNV ¹⁴² . Другие исследования дают аналогичные результаты ^{143 – 145} . Было описано много частных CNV (специфичных для семьи), и есть ограниченное совпадение в списках CNV, найденных в различных полногеномных поисках ⁶ . Многие CNV были зафиксированы в линиях человека и других приматов и теперь рассматриваются как LCR ^{10 , 12 , 13 , 146} .Эти. Низкая частота в популяциях почти каждого описанного полиморфизма CNV предполагает, что некоторые из CNV, которые мы видим сейчас, имеют тенденцию к фиксации.

Однако существует неопределенность в определении CNV, вызванная разными критериями длины и степени гомологии, которые определяют CNV, и использованием различных методов. Существует проблема в отношении эталонного генома из-за широко распространенного полиморфизма CNV и того факта, что эталон был установлен как гаплоидный геном, а не естественное диплоидное состояние.Относительная редкость конкретных CNV, описанных выше, была поставлена ​​под сомнение в результате исследования, показавшего, что 80% CNV обнаруживаются более чем у 5% людей ¹⁴⁷ .

Однако большой разброс количества копий является невыгодным. Изменение количества копий участвует в формировании и прогрессировании рака ^{19 , 20} и способствует предрасположенности к раку ²¹ . Во многих ситуациях изменение числа копий любого из ряда конкретных генов плохо переносится и приводит к группе патологических состояний, известных как геномные нарушения ²² .Поскольку определенные генные дисбалансы связаны с конкретными клиническими синдромами, доступны редкие клинические случаи изменения числа копий, которые облегчили изучение хромосомных изменений, лежащих в основе CNV. Дополнительные примеры были получены из исследований полных геномов и из полногеномных обзоров CNV с помощью таких методов, как сравнительная геномная гибридизация массива (aCGH) ⁵ , сравнение уровней экспрессии ²³ или картирование парных концов ² .

Механизмы структурных изменений хромосом были изучены на модельных организмах, особенно на пекарских дрожжах, Escherichia coli и Drosophila.Объединив результаты модельных организмов с характеристиками CNV в геномах человека и приматов, мы можем начать работать над пониманием процессов, которые приводят к структурным изменениям хромосом, и таким образом получить представление об основном компоненте сил, которые движут эволюция человека ²⁴ . Экстраполяция от одного организма к другому не всегда надежна, но она оказалась очень успешной при изучении процессов, действующих на ДНК. Почти все механизмы репарации ДНК, действующие у человека, были впервые описаны на модельных организмах, особенно на бактериях ²⁵ .В этом обзоре мы описываем свойства CNV и механизмы, которые приводят к изменению количества копий.

Характеристики вариантов числа копий

Изменение числа копий требует изменения структуры хромосомы, объединяющей две ранее разделенные последовательности ДНК. Эти соединения дают важное представление о том, как возникли структурные изменения. Многие изменения показывают повторяющиеся конечные точки. То есть большинство событий в данном локусе имеют конечные точки, ограниченные несколькими геномными позициями.Соединения этих повторяющихся CNV находятся в низкокопийных повторах (LCR), которые обеспечивают обширную гомологию. LCR, также называемые сегментарными дупликациями, представляют собой последовательности, которые встречаются в геноме дважды или несколько раз. Для практических целей определение ограничено степенью идентичности (обычно> 95%) и длиной (обычно> 1 или 5 пар килобаз). Вероятно, что повторяющиеся CNV возникли в результате гомологичной рекомбинации между повторяющимися последовательностями. Этот процесс называется неаллельной гомологичной рекомбинацией (NAHR) и обсуждается ниже.

Другие структурные изменения показывают единовременные конечные точки. Большинство неповторяющихся CNV встречаются в сайтах с очень ограниченной гомологией от 2 до 15 пар оснований (п.н.) (например, ^{26 – 28} ), что слишком мало для того, чтобы возникать в результате гомологичной рекомбинации (HR), как обсуждается ниже. Другой характеристикой неповторяющихся событий является то, что структурные изменения хромосом могут быть сложными, с короткими последовательностями, вставленными из других мест в местах соединений, и включающими смесь дупликаций, троек, инверсий и делеций и чередующихся с длинами неизмененной последовательности ^{29 – 32} .Пример сложной перестройки с микрогомологическими стыками показан на рис. Третья характеристика заключается в том, что, хотя неповторяющиеся соединения не совпадают с LCR, они, как правило, возникают вблизи регионов, богатых LCR, прямыми или инвертированными, что приводит к сложной региональной геномной архитектуре ^{33 – 35} . Происхождение LCR и регионов, в которых преобладают LCR, по-видимому, совпадает с происхождением неповторяющихся событий, которые мы наблюдаем сегодня, и, следовательно, механизмы неповторяющегося изменения числа копий являются механизмами эволюции геномов.

Пример сложной геномной перестройки с микрогомологическими соединениями, в которых удалено около 10 т.п.н., включая экзон 4 гена PMP22 человека ¹⁸ . A представляет собой часть карты нормалей части PMP22 . Блоки последовательности различаются по цвету. B представляет собой гипотетическую серию из 3 шаблонных переключателей, которые будут выполнять перегруппировку. Переключения могли произойти в обратном порядке. Номера соответствуют узлам, указанным ниже. C показывает реаранжированную хромосомную область с делецией экзона 4, соединяющей коричневую последовательность с желтой последовательностью, с последующей инверсией части удаленного сегмента (фиолетовый) и прямым дублированием части последовательности (зеленый). Da показывает нуклеотидные последовательности окрашенных сегментов одним и тем же цветом, где верхняя строка – родительская последовательность, вторая строка – последовательность перестроенной хромосомы, а нижняя строка – родительская взаимодействующая последовательность с другой стороны удаление.Переход коричневой и желтой последовательности показывает микрогомологию 4 п.н. (красный). b показывает последовательности, которые взаимодействовали, чтобы образовать соединения 2 и 3. Вторая линия имеет новую последовательность, соединяющую желтую и инвертированную красную последовательность (третья линия) с микрогомологией 5 п.н., а четвертая линия показывает последовательность, которая взаимодействовала в инвертированной ориентации. сделать стык 3 с микрогомологией 3 п.н.

Механизмы структурных изменений

Изменение числа копий включает изменение структуры хромосом, так что ранее разделенные хромосомные области теперь сопоставляются.Поскольку механизмы всех структурных изменений такие же, как и механизмы, вызывающие CNV, мы обсуждаем их здесь для понимания того, что они дают о механизмах изменения числа копий.

Изменения в структуре хромосом происходят по двум основным механизмам: гомологичная рекомбинация (HR) и негомологичная рекомбинация. HR требует обширной идентичности последовательности ДНК (около 50 п.н. в E. coli ³⁶ , до 300 п.н. в клетках млекопитающих и человека ^{37 , 38} ), и для большинства механизмов также требуется белок обмена цепей. , RecA у прокариот и его ортолог Rad51 у эукариот.Причина этого двойного требования заключается в том, что ранней стадией наиболее гомологичной рекомбинации является катализируемое RecA / Rad51 вторжение в гомологичную дуплексную последовательность 3′-концом одноцепочечной ДНК, то есть 3′-конец заменяет аналогичную цепь дуплекс. Напротив, негомологичные механизмы рекомбинации используют только микрогомологию нескольких комплементарных пар оснований или отсутствие гомологии. HR является основой нескольких механизмов точной репарации ДНК, которые используют другую идентичную последовательность для восстановления поврежденной последовательности.Хромосомные структурные изменения могут происходить с помощью HR не потому, что механизм неточен, а потому, что в геномах есть участки LCR или сегментарные дупликации. Не будет никаких изменений в структуре, если поврежденная последовательность будет восстановлена ​​с использованием гомологичной последовательности в одном и том же хромосомном положении в сестринской хромосоме или гомологе, но при восстановлении могут использоваться гомологичные последовательности в разных хромосомных положениях. Это называется неаллельной или эктопической гомологичной рекомбинацией (NAHR) ³⁹ . Напротив, любой механизм, который восстанавливает поврежденную молекулу с использованием последовательности из негомологичной матрицы, имеет возможность изменить структуру хромосом.

Механизмы гомологичной рекомбинации

HR лежит в основе многих процессов репарации ДНК, а также отвечает за упорядоченную сегрегацию хромосом и за создание новых комбинаций связанных аллелей при мейозе. HR используется для восстановления разрывов и разрывов ДНК. Наиболее изученным механизмом HR является рекомбинация, вызванная двухцепочечным разрывом (DSB). Интенсивные исследования DSB-индуцированной мейотической рекомбинации и рекомбинации, индуцированной сайт-специфическими нуклеазами, позволили нам понять механизмы репарации DSB.Однако спонтанная митотическая рекомбинация, вероятно, инициируется другими типами повреждений ДНК, такими как одноцепочечные разрывы ДНК.

В следующих разделах мы описываем HR-механизмы восстановления DSB как для ситуаций, когда присутствуют два двухцепочечных конца, так и для случаев, когда есть только один, и мы показываем, как эти механизмы могут привести к генерации числа копий или избежать ее. вариация. Все модели представляют собой гипотезы, основанные на имеющихся доказательствах, поэтому реальность может не точно соответствовать изображенным механизмам.

Модели двойного соединения Холлидея и зависимого от синтеза отжига цепи репарации двухцепочечного разрыва

иллюстрирует репарацию DSB двойного соединения Холлидея, механизм, который может приводить к конверсии и кроссинговеру генов, и зависимому от синтеза отжигу цепи (SDSA) ( рассмотрено в ^{40 , 41} ), который не генерирует кроссоверы. SDSA, по-видимому, скорее, является механизмом предотвращения кроссинговера и потери гетерозиготности (LOH), хотя все еще способным вызывать изменение числа копий, когда матрица ДНК содержит прямые повторы (обзор ⁴¹ ).

Механизмы гомологичной рекомбинации. A и B Ремонт двунитного разрыва; С . Ремонт двухрядных концов. A. Репарация рекомбинационного двухцепочечного разрыва двойного соединения Холлидея. В месте разрыва (a) 5 ‘концы резецированы (b), чтобы оставить выступающие хвосты 3′ (половинки наконечников стрелок). Они покрыты RecA / Rad51, который катализирует вторжение одного или обоих концов в гомологичную последовательность, образующую D-петлю (c). Затем 3’-конец запускает синтез ДНК (пунктирные линии), который выходит за пределы положения исходного разрыва (d).Второй конец включен в D-петлю путем отжига и также удлиняется (e). После лигирования, которое образует двойное соединение Холлидея (f), соединения разрешаются эндонуклеазой (g). Общий эффект будет либо отсутствием кроссовера, либо кроссовером, в зависимости от того, разрешены ли два перехода в одной или разных ориентациях. Альтернативный путь разрешения опосредуется геликазой и топоизомеразой, чтобы сходиться и разрушать двойное соединение Холлидея, генерируя только результат без кроссовера ⁴⁸ (h). B. Зависящий от синтеза отжиг цепи происходит по тому же пути, что и в A , через удлинение полимеразы (d). На этом этапе вторгающийся конец вместе с вновь синтезированной ДНК отделяется от матрицы с помощью геликазы (е). Теперь он встречается со вторым концом двухцепочечного разрыва и отжигается с ним за счет комплементарного спаривания оснований (f) (пунктирная стрелка). Второй конец удлиняется путем синтеза ДНК (g) и лигируется, завершая репарацию. C. Репликация, индуцированная разрывом, происходит в свернутых (сломанных) вилках репликации, которые возникают, когда репликативная геликаза на вилке репликации встречает разрыв в цепи шаблона (сплошная стрелка) (a и b).Репликацию, индуцированную разрывом, можно понимать как модификацию SDSA. Как и раньше, 3′-хвост вторгается в гомолог (d), обычно сестру, от которой он оторвался, и удлиняется полимеризацией с низкой процессивностью, которая включает как ведущие, так и отстающие нити ¹⁰⁴ (e). Однако отделенный удлиненный конец 3 ‘не может найти дополнительный второй конец, который можно отжечь (f). Затем конец повторяется (g) и удлиняется репликационной вилкой с низкой процессивностью. Этот процесс вторжения, расширения и разделения может повторяться несколько раз, пока не сформируется более процессная репликационная вилка (h).Теперь вилка может завершить репликацию до конца молекулы ⁵⁰ (i). В (g) и (h) мы показываем соединение Холлидея, следующее за вилкой репликации, что дает консервативное разделение старой и новой ДНК. Также возможно, что соединение Холлидея расщеплено эндонуклеазой, и в этом случае сегрегация будет полуконсервативной. Во всех частях рисунка каждая линия показывает одну нуклеотидную цепь. Полярность обозначена половинными стрелками на концах 3 ′. Новый синтез показан пунктирными линиями.Нарушенная молекула ДНК показана красным цветом, гомолог или сестринская молекула – зеленым.

Кроссинговер между гомологичными хромосомами может привести к LOH, если хроматиды, несущие одни и те же аллели, разделяются вместе при митозе. Если кроссовер образуется, когда взаимодействующие гомологии находятся в неаллельных положениях на одной и той же хромосоме (NAHR), это приведет к дупликации и удалению последовательности между повторами (рис. 3Aa). Кроссинговер во время внутрихромосомной рекомбинации между прямыми или инвертированными повторами приводит к делеции или инверсии соответственно.Во всех протестированных организмах, включая человека, наблюдается смещение вегетативных клеток в сторону неперекрестного результата (например, ^{42 , 43} ). Различия в частоте кроссинговера можно объяснить, если HR часто протекает в соответствии с моделью двойного соединения Холлидея () в мейотических клетках и через SDSA () в митотических клетках. Несколько различных ДНК-геликаз и топоизомераз могут направлять репарацию DSB в непересекающийся путь либо путем раскручивания D-петли после вторжения цепи, примированной новым синтезом ДНК ^{44 – 47} (Рисунок 2Be), либо путем разрешения двойного соединения Холлидея в непересекающийся (Рисунок 2Ah) ⁴⁸ .Также кроссинговеры с меньшей вероятностью образуются во время ЧСС между короткими повторами, вероятно, из-за сниженной способности образовывать промежуточное звено кроссинговера – двойное соединение Холлидея ⁴⁹ .

HR используется не только для восстановления двусторонних двухцепочечных разрывов (и B), но также для восстановления свернутых или сломанных репликационных вилок () в процессе, называемом репликацией, индуцированной разрывом (BIR). Этот процесс обычно точен и не оставляет следов, за исключением того, что если сломанный конец вторгается в гомолог вместо сестринской молекулы, это может привести к LOH.Если репарация включает гомологичную последовательность в другом положении хромосомы, может произойти транслокация ⁵⁰ , дупликация или делеция, что составляет альтернативный механизм для NAHR (рис. 3Ab). BIR был предложен в качестве механизма для достижения структурных изменений хромосомы несколькими авторами ^{31 , 51 – 55} , и ниже мы предлагаем, что он лежит в основе основного механизма изменения количества копий.

Небольшие делеции могут образовываться за счет механизма репарации разрывов, действующего в непосредственно повторяющихся последовательностях.Однонитевой отжиг (SSA) был впервые описан в клетках млекопитающих и амфибий ^{56 , 57} . SSA происходит, когда ни один конец двухцепочечного двухцепочечного разрыва не вторгается в гомологичную последовательность. В этом случае эрозия 5′-концов продолжается, обнажая значительные длины однонитевых 3′-концов (). Если в этом процессе обнаруживаются комплементарные последовательности в двух одиночных цепях, может произойти отжиг. После удаления створок и лигирования сломанная молекула была восстановлена, но вся последовательность между повторяющейся последовательностью и одним из самих повторов была удалена.Поскольку нет стадии инвазии, SSA не требует RecA / Rad51, но требует отжигающего белка Rad52. SSA был изучен на дрожжах ⁵⁸ , где было обнаружено, что в большинстве случаев он ограничивается делециями до нескольких десятков пар тысяч оснований. Чем длиннее последовательность, разделяющая повторы, тем меньше вероятность того, что резекция достигнет обоих повторов, так что разрыв будет восстановлен с помощью SSA. Это ограничение длины означает, что SSA, вероятно, будет лишь второстепенным игроком в формировании CNV.У человека DSB-индуцированный SSA наблюдался между идентичными Alu повторами, разделенными несколькими сотнями пар оснований ⁵⁹ .

Изменение количества копий в результате гомологичной рекомбинации. A. Неаллельная гомологичная рекомбинация (NAHR). (Aa) Если событие репарации рекомбинации использует прямой повтор (b) в качестве гомологии, результат кроссовера (обозначенный как «x») приводит к продуктам, которые взаимно дублируются и удаляются для последовательности (c) между повторами. Они могут отделяться друг от друга при следующем делении клетки, тем самым изменяя количество копий в обеих дочерних клетках.NAHR может также возникать с помощью BIR, когда сломанная молекула использует эктопическую гомологию для перезапуска репликационной вилки (Ab). BIR будет формировать дублирование и удаление в отдельных мероприятиях. B. Однонитевой отжиг. Когда резекция 5′-конца по обе стороны от двухцепочечного разрыва не приводит к инвазии гомологичной последовательности, резекция продолжается. Если эта резекция обнаруживает комплементарную одноцепочечную последовательность (b), показанную утолщенными линиями, они могут отжигаться. Удаление лоскутов, заполнение промежутков и лигирование завершают репарацию двухцепочечного разрыва с удалением последовательности между повторами (с) и одного из повторов.Каждая линия представляет одну цепь ДНК, полярность указана половинными стрелками на 3′-концах, а конкретные последовательности обозначены буквами от «a» до «d».

Правильный выбор партнера рекомбинации предотвращает структурные изменения хромосомы

Многие из описанных здесь путей структурных изменений хромосом являются результатом выбора неаллельного партнера для репарации. Клетки регулируют выбор партнера для ремонта несколькими способами. Ремонт с несоответствием является первым препятствием для выбора гомеологической последовательности для ремонта.В E. coli это предположительно связано с тем, что MutS и MutL вместе отменяют спаренные по основанию молекулы ДНК, которые не полностью совпадают ⁶⁰ . Гомеологичные последовательности представляют собой аналогичные последовательности, которые обладают менее чем примерно 95% идентичностью. Ремонт несоответствия также предотвращает взаимодействие с очень короткими длинами гомологии. Во-вторых, сестринская хроматида является предпочтительным партнером для рекомбинационной репарации. Белки, которые удерживают вместе две сестринские хроматиды, называются когезинами. Когезины собираются в DSB как у дрожжей, так и у человека ^{61 – 63} и способствуют восстановлению DSB ⁶⁴ .Когезины ограничивают возможность использования внутрихромосомных или межхромосомных неаллельных рекомбинационных шаблонов. В дрожжах когезины регулируют количество копий тандемных повторов гена рибосомной РНК (рДНК) ⁶⁵ . Повторы рДНК подвержены делециям и вставкам. Было высказано предположение, что транскрипция внутри рДНК разрушает когезины локально, что приводит к выбору неаллельных повторов для репарации в рДНК, что приводит к изменению числа копий ⁶⁶ . Однако клетки реагируют на такие изменения, регулируя рекомбинацию, чтобы вернуть количество повторов к нормальному уровню.Кажется вероятным, что потеря сцепления может вызвать изменение числа копий в других локусах.

Помимо того, что две сестринские хроматиды удерживаются вместе при повреждении ДНК, дрожжевые и человеческие клетки также удерживают вместе два конца одного DSB ^{67 , 68} . Sgs1, ортолог геликазы BLM человека, является одним из белков, которые координируют выбор матрицы двумя концами DSB ^{69 , 70} . Однако многочисленные отчеты демонстрируют, что два конца одного DSB могут участвовать в рекомбинации с разными гомологичными матрицами.Копирование разных последовательностей двумя концами одного DSB из разных шаблонов приведет к перегруппировке.

Хотя HR обеспечивает жизненно важные механизмы восстановления, он также опасен, о чем свидетельствуют многие способы, которыми он может влиять на структурные изменения хромосомы, включая изменение числа копий. Механизмы восстановления HR минимизируют это, избегая кроссинговера, регулируя выбор партнера и требуя значительной длины идеальной гомологии. Однако для мейоза необходим кроссинговер, и мы видим возможное влияние этого в повышенной частоте CNV, возникающей в мейозе (Box 2).

Вставка 2 Когда и как часто происходят изменения CNV?

Большая часть CNV возникает как наследственный полиморфизм, но также возникает de novo со значительной скоростью. Очевидно, что CNV возникает как в зародышевой линии, так и в соматических клетках. Исследование четырех горячих точек, в которых возникает CNV, с помощью NAHR ¹⁴⁸ обнаружило частоту CNV от 10 ^-6 до 5 × 10 ^-5 на гамет, как определено с помощью анализа сперматозоидов. Исследование, в котором использовались аналогичные методы для анализа крови и спермы 2 человек на предмет NAHR-опосредованных делеций в генах α-глобина, показало, что частота более 10 ^-6 в клетках крови и на порядок выше в сперматозоидах ¹⁴⁹ .Аналогичные результаты были получены для дупликаций в генах α-глобина ¹⁵⁰ . Анализ крови на три специфических хромосомных инверсии, возникающих в результате NAHR между инвертированными LCR, обнаружил очень высокие частоты в диапазоне от 10 ^-4 до 10 ⁰ . Новорожденные несут гораздо меньше продукта NAHR, что позволяет предположить, что соматические структурные изменения накапливаются в течение жизни ¹⁵¹ . Имеется мало сопоставимых данных для CNV, вызванных единовременными изменениями. Сообщалось об обширном соматически генерированном CNV между различными линиями эмбриональных стволовых клеток, происходящими от одних и тех же инбредных лабораторных линий мышей ¹⁵² .Большинство, но не все варианты были связаны с LCR, что позволяет предположить NAHR. Таким образом, скорость возникновения CNV на несколько порядков выше, чем скорость точечных мутаций, и особенно высока во время мейоза.

Недавно были рассмотрены данные о возникновении спорадических геномных нарушений ¹⁵³ , сообщающие о частотах в диапазоне от 10 ^-6 до 10 ^-4 CNV на гамету, включая непериодические перестройки в локусе DMD ¹⁵⁴ . Это на два-четыре порядка больше, чем для точечной мутации ¹⁵³ , и хорошо согласуется с оценкой по сперматозоидам (выше ¹⁴⁸ ).Однако есть заметная разница в том, что делеции были примерно в два раза чаще, чем дупликации в сперматозоидах, в то время как у здоровых людей делеции и дупликации примерно одинаково распространены ⁴ . Это говорит о том, что существует меньшая селекция против дублирования CNV, чем против делеций, поскольку сперматозоиды не подвергаются селективному давлению во время развития.

Интересно предположить, что высокая скорость генерации CNV сыграла роль в быстрой эволюции линии приматов ¹² .Крыса и мышь имеют меньше LCR, чем человек ¹⁵⁵ . Лабораторные штаммы мышей обнаруживают CNV, и он локализуется совместно с LCR, что указывает на NAHR ¹⁵⁶ . Таким образом, при низкой встречаемости LCR образование de novo CNV будет значительно ниже, чем у человека. Напротив, CNV и LCR у шимпанзе, по-видимому, развиваются со скоростью, сравнимой с таковой у человека ^{10 – 13} .

Негомологичная репарация

В дополнение к путям HR существуют механизмы репарации ДНК, которые используют очень ограниченную гомологию или ее отсутствие.Когда гомология не используется для обеспечения воссоединения молекул в правильных положениях, существует некоторая вероятность того, что это приведет к генетическим изменениям, включая CNV. Эти механизмы, не использующие HR, можно разделить на репликативные и нерепликативные.

Негомологичная репарация: нерепликативные механизмы

Негомологичное соединение концов

Существует два пути репарации DSB, которые либо не требуют гомологии, либо требуют очень коротких микрогомологий для восстановления: негомологичное соединение концов (NHEJ) и соединение концов, опосредованное микрогомологией ( MMEJ).Эти пути недавно были подробно описаны в другом месте ^{71 – 73} . NHEJ точно присоединяется к концам DSB или приводит к небольшим делециям 1-4 п.н., а также в некоторых случаях к вставке свободной ДНК, часто из митохондрий или ретротранспозонов ^{74 , 75} . MMEJ использует гомологии длиной от 5 до 25 пар оснований для отжига с концами DSB и, как SSA, приводит к делециям последовательностей между отожженными микрогомологиями. Второе различие между этими путями состоит в том, что они требуют разных белков.Ключевые белки, участвующие в NHEJ (Ku70 / Ku80), не требуются для MMEJ. Также для MMEJ не требуется белок отжига цепи Rad52, что отличает этот путь от SSA.

Вероятно, что NHEJ и MMEJ вносят вклад в некоторые хромосомные перестройки путем присоединения негомологичных последовательностей. Это возможно во время репарации двухконцевых DSB, таких как вызванные эндонуклеазой разрывы, повреждение экзогенными агентами, включая химиотерапевтические агенты, или когда две сходящиеся репликационные вилки сталкиваются с разрывом в ДНК.Запрограммированные двусторонние DSB возникают в иммунной системе, и их восстановление может быть связано с образованием некоторых транслокаций, наблюдаемых у пациентов с лейкемией (обзор ⁷⁶ ). Запрограммированные двусторонние DSB также встречаются в клетках, претерпевающих мейоз, где они инициируют HR. Как обсуждается ниже, односторонний DSB, вероятно, будет более частым спонтанным поражением и реплицироваться репликативно.

Цикл разрыва-слияния-моста

После репликации хромосомы, которая потеряла теломер из-за DSB, будут две сестринские хроматиды, у которых отсутствуют теломеры.McClintock ⁷⁷ предположил, что сестринские хроматиды, у которых отсутствуют теломеры, будут сливаться, создавая дицентрическую хромосому (). Во время анафазы две центромеры будут вытянуты, чтобы разделить ядра, что в конечном итоге приведет к поломке дицентрической хромосомы. После репликации разрыв приведет к новым концам, в которых отсутствуют теломеры, так что эти концы снова сливаются, образуя новую дицентрическую хромосому, и устанавливается цикл. Случайная поломка вызывает большие перевернутые дупликации, а повторяющиеся циклы могут привести к усилению перевернутого повтора.Цикл прекратится, когда хромосома приобретет теломер. Этот процесс, цикл разрыва-слияния-моста, был связан с образованием амплификации в клетках млекопитающих (обзор ⁷⁸ ), и считается, что он играет важную роль в амплификации при раке. Случайный разрыв дицентрической хромосомы, образованный слиянием концов сестринских хроматид, обеспечивает легкое объяснение появления больших инвертированных повторов в раковых клетках человека ⁷⁹ . Цикл разрыв-слияние-мостик может быть вызван ферментативным разрывом хромосом и ингибированием синтеза ДНК ⁸⁰ , а образующиеся мосты можно наблюдать под микроскопом.

Цикл «разрыв-сплавление моста». (а) Нереплицированная хромосома страдает двухцепочечным разрывом, в результате чего она теряет теломер. (б) При репликации обе сестринские хроматиды лишены теломер. (c) Предполагается, что эти два конца сливаются, (d) образуя дицентрическую хромосому. (e) В анафазе две центромеры дицентрической хромосомы раздвигаются, первоначально образуя мост между ядрами телофазы. (f) В конце концов мост сломан в случайном месте. Это неизбежно приводит к образованию большой перевернутой дупликации.Хромосома снова имеет незащищенный конец, и после репликации сформируются две сестры, которые могут слиться, чтобы заново сформировать дицентрическую хромосому, и поэтому процесс повторяется до тех пор, пока конец не получит теломер из другого источника. Усиление большого перевернутого дублирования может происходить из-за случайной поломки в более поздних циклах (не показано). Центромеры обозначены синим кружком, теломеры – черным блоком, а геномная последовательность – красными стрелками, показывающими ориентацию. Точки разлома показаны двойными черными линиями, а потерянные фрагменты – серым.

Некоторые события, которые изменяют структуру хромосомы, которые были приписаны циклу разрыв-слияние-мост, также могут быть вызваны любым повторяющимся процессом негомологической рекомбинации без повторного разрыва и слияния ⁵⁵ . Ясно, что когда транслокация формируется в перевернутой ориентации, создавая дицентрическую хромосому, потребуется второе событие для восстановления стабильности генома. Это второе событие может быть частью первого события, как описано в репликативных моделях ниже, а не быть результатом образования анафазного мостика.

Негомологичная репарация: репликативные механизмы

Присутствие микрогомологии в сайте негомологичной рекомбинации считается признаком NHEJ ^{34 , 81} . Однако по мере накопления данных о том, что образование микрогомологических соединений в некоторых случаях связано с репликацией ДНК, все чаще упоминаются репликативные механизмы, в частности, BIR предлагается в качестве механизма ^{24 , 31 , 51 , 52 , 54 , 55} .Доказательства участия репликации по крайней мере в некоторых структурных изменениях хромосом были недавно рассмотрены ²⁴ . Появляется все больше свидетельств того, что репликативный стресс может лежать в основе изменения количества копий. Афидиколин, ингибитор репликативных ДНК-полимераз, индуцирует CNV как на уязвимых участках хромосом, так и во всем геноме ^{80 , 82 – 85} . Это предполагает основанный на репликации механизм с участием двухцепочечных концов ДНК, поскольку известно, что они возникают в результате ингибирования репликации ⁸⁶ .В одном исследовании было обнаружено, что новые CNV, индуцированные афидиколином, имеют микрогомологию (65%) или отсутствие гомологии в своих конечных точках, показывая, что они не возникли по HR ⁸² . В следующих разделах мы исследуем репликативные механизмы, которые были предложены в качестве источника CNV.

Проскальзывание репликации или переключение матрицы

Когда короткие длины идентичности последовательности ДНК встречаются в пределах длины генома, которая, как ожидается, будет одноцепочечной во время репликации, т. Е. Длина фрагмента Окадзаки 1 или 2 килобайт или меньше у человека, последовательность между гомологичными длинами часто удаляется или дублируется.Это было связано с механизмом проскальзывания репликации вдоль экспонированной матрицы во время репликации ДНК ^{87 , 88} (см.). В E. coli проскальзывание репликации может происходить в отсутствие RecA ^{87 – 90} и сильно зависит от длины гомологии ^{87 , 91 , 92} и расстояние между повторяющимися единицами ^{91 , 93 , 94} .Частота этих событий увеличивается из-за мутаций в генах, кодирующих компоненты репликативного холофермента ДНК-полимеразы, предположительно потому, что нарушение репликации способствует проскальзыванию ^{95 – 97} . Когда повторяющиеся последовательности не идентичны (т.е. они содержат несовпадения), частота проскальзывания репликации выше у мутантов, несущих мутацию в системе восстановления несовпадений ⁹⁸ . В совокупности с неспособностью найти генетические требования для короткой делеции гомологии ⁹⁷ (предполагая, что задействованы важные функции, так что большинство мутаций в этих генах сделают клетки неактивными) и отсутствием каких-либо требований к функциям HR ⁹⁷ все свидетельства указывают на репликативный механизм.Из-за очень сильного ограничения расстояния предлагается, чтобы механизм проскальзывания репликации работал внутри репликационной вилки и поэтому не может учитывать большинство событий, которые изменяют количество копий у человека, где задействованы расстояния от десятков килобаз до мегабаз.

Репликативные механизмы негомологичных структурных изменений. A. Проскальзывание репликации. (а) во время репликации часть матрицы отстающей нити становится открытой как одна нить. (b) независимо от того, из-за вторичных структур в матрице отстающей цепи, 3′-конец праймера может перемещаться в другую последовательность, демонстрирующую небольшую длину гомологии на экспонированной матрице, и (c) продолжать синтез после того, как не удалось скопировать часть шаблон.Как показано, это приведет к удалению. Несколько вариаций этого механизма могут также приводить к дублированию длины последовательности ДНК с обменом сестринских хроматид или без него (обзор ¹⁵⁷ ). События, происходящие с помощью этого механизма, ограничиваются длиной генома, который можно найти в одной репликационной вилке (от 1 до 2 КБ). B. Блокировка вил и переключение шаблонов (FoSTeS) ^{26 , 100} . Открытый одноцепочечный шаблон отстающей цепи (a) может приобретать вторичные структуры (b), которые могут блокировать продвижение репликационной вилки.Затем 3′-концы праймера освобождаются от своих матриц (c) и могут затем попадать на другую открытую одноцепочечную матричную последовательность на другой вилке репликации, которая имеет общую микрогомологию (d), вызывая тем самым дупликацию, делецию, инверсию или транслокацию в зависимости от относительное положение другой вилки репликации. Остановка вилки может быть вызвана другими ситуациями, такими как повреждения в матричной цепи или нехватка дезоксинуклеотидтрифосфатов. C. Репликация, опосредованная микрогомологией, индуцированная разрывом (MMBIR).(a) Коллапс репликационной вилки, при котором одна рука отламывается от репликационной вилки, может происходить из-за того, что вилка встречает зарубку на цепи-шаблоне, или может быть вызвано эндонуклеазой. (b) 5′-конец разорванной молекулы (красный) будет углублен из разрыва, обнажив 3′-хвост. Когда присутствует недостаточно RecA или Rad51, чтобы позволить инвазию гомологичного дуплекса, как показано на, 3′-хвост будет отжигаться с любой экспонированной одноцепочечной ДНК, которая имеет общую микрогомологию. (c) показывает отжиг 3′-хвоста с шаблоном отстающей нити другой репликационной вилки (синий).(d) показывает создание репликационной вилки с синтезом как ведущей, так и отстающей цепи от микрогомологического соединения. (e) Репликация имеет низкую процессивность, и сломанный конец, теперь увеличенный на длину другой последовательности, показанной синим цветом, отделяется от шаблона и снова обрабатывается до 3 ‘хвоста, который затем отжигается с другим одноцепочечная микрогомологическая последовательность. (f) расширенный сломанный конец, теперь несущий как последовательность, обозначенную синим, так и длину другой последовательности, обозначенную зеленым, отжигается с одноцепочечной последовательностью обратно на красную молекулу.В этом случае одноцепочечная последовательность показана как локально расплавленная длина ДНК. (g). Устанавливается еще одна вилка с короткой процессивностью, но эта вилка становится полностью процессивной вилкой репликации (h), которая может продолжаться до конца хромосомы или репликона. (i) показывает полученную молекулу, несущую короткие последовательности из других участков генома. Дублируется или удаляется длина красной последовательности, зависит от положения, в котором синтез возвращается к красной хромосоме относительно того места, где произошел коллапс начальной вилки.Если вторая черная последовательность является гомологичной хромосомой, а не сестринской хроматидой, то после события будет обширный LOH. Каждая линия представляет собой одну цепь ДНК, полярность указана половинными стрелками на 3’-концах, а стрелки показывают положение надрезов и разрывов. Узлы микрогомологий обозначены черными штрихами.

Остановка вилки и переключение шаблона

Исследование стресс-индуцированной амплификации генов lac с использованием E.coli Lac system of Cairns and Foster ⁹⁹ led Slack et al. ¹⁰⁰ , чтобы предложить, чтобы переключение шаблонов не ограничивалось отдельными ветвями репликации, но могло также происходить между разными ветвями репликации. Эта модель, теперь называемая остановкой вилки и переключением матрицы (FoSTeS) ²⁶ , проиллюстрирована в, предполагает, что, когда вилки репликации останавливаются в клетках в условиях стресса, 3′-конец праймера цепи ДНК может изменять матрицы на одноцепочечные матрицы ДНК в другие расположенные поблизости вилки репликации.Эта гипотеза была необходима, потому что средняя длина амплифицированных единиц (ампликонов) в этом исследовании составляла около 20 т.п.н. ¹⁰⁰ , что слишком долго, чтобы иметь место в вилке репликации. Доказательство того, что механизм был репликативным, было первым, что соединения между ампликонами показали только микрогомологию от 4 до 15 пар оснований ^{100 , 101} , показывая, что HR не участвует. Во-вторых, существует потребность в ДНК-полимеразе I, особенно в 5′-концевом эндонуклеазном домене.Это связано с отстающими цепями в ответвлениях репликации, потому что другие функции этой нуклеазы в эксцизионной репарации не участвуют ¹⁰⁰ . В-третьих, сверхпродукция основной 3′-экзонуклеазы однонитевой ДНК, ExoI, снизила частоту перестроек, подразумевая, что 3′-концы ДНК способствуют амплификации, а также предполагая, что синтез ДНК праймируется с 3′-концов во время амплификации ¹⁰⁰ . Обратное увеличение наблюдалось для делеции гена ExoI в событиях короткодействующей делеции ^{102 , 103} и интерпретировалось таким же образом.Физические свойства ампликонов, микрогомология на границах и сложность структуры ампликонов в E. coli ^{100 , 101} также оказались свойствами дупликаций и делеций человека, как обсуждалось ранее. выше. Это привело к предположению ^{26 , 100} , что тот же механизм участвует в формировании некоторых хромосомных перестроек человека.

Microhomology-mediated break-индуцированная репликация

Другие авторы предположили, что BIR может опосредоваться микрогомологией, например Payen et al . ⁵⁴ , которые продемонстрировали участие BIR в опосредованной микрогомологией негомологичной рекомбинации, продемонстрировав потребность в Pol32. Pol32 представляет собой несущественную ДНК-полимеразу, которая, как было показано, необходима для BIR в дрожжах ¹⁰⁴ . Баутерс и др. . ⁵¹ привлекла опосредованную микрогомологией BIR для объяснения неповторяющихся изменений числа копий у человека. Обе эти группы предположили, что существует опосредованное микрогомологией вторжение в двухцепочечную ДНК. Мы, однако, предполагаем, что вторжение не произойдет без обширной гомологии, поэтому мы должны искать механизм, отличный от вторжения, когда задействована только микрогомология.

Модель FoSTeS не предлагает механистических молекулярных деталей, не включает концы двухцепочечных ДНК и не поддается тестированию. На смену FoSTeS теперь пришла новая модель, модель микрогомологии-опосредованной разрывом-индуцированной репликации (MMBIR), основанная на механизме BIR-репарации одинарных двухцепочечных концов ²⁴ (). Предполагается, что когда единственный двухцепочечный конец является результатом коллапса репликационной вилки в клетке при стрессе, RecA / Rad51 подавляется как часть стрессовой реакции, так что классическая репарация BIR двухцепочечного конца не может происходить.BIR сильно зависит от RecA / Rad51, поскольку включает вторжение 3′-конца ДНК в двухцепочечную ДНК партнера по репарации. Однако известно, что BIR происходит с низкой скоростью в отсутствие Rad51 ^{105 , 106} . MMBIR постулирует, что, поскольку инвазия цепи ограничена или невозможна при понижающей регуляции RecA / Rad51, 3′-конец свернутой вилки будет отжигаться с любым однонитевым шаблоном, с которым он имеет общую микрогомологию и который происходит в физической близости к 3 ‘Конец ДНК и инициируют синтез ДНК и репликационную вилку с низкой процессивностью.Одноцепочечная ДНК будет встречаться в других ответвлениях репликации, особенно в матрице отстающей цепи, в трактах эксцизионной репарации, в сайтах транскрипции и во вторичных структурах ДНК. Эта реакция отжига не требует RecA / Rad51 и требует очень небольшой гомологии, так что отжиг будет происходить с сестринской молекулой либо впереди, либо за положением коллапса вилки, что приведет к делеции или дупликации соответственно, и в любой ориентации, давая возможность сформировать инверсию.Микрогомология также может быть обнаружена в другой хромосоме, что приводит к транслокации. Отжиг с гомологичной хромосомой вместо сестры может быть причиной обширного LOH. Повторяющееся расширение и отделение от шаблона, которые характерны для BIR ⁵⁰ , вызовут некоторые из этих изменений в одном и том же событии, что приведет к наблюдаемой сложности. Способность этого механизма легко объяснять сложность множественных соединений в непосредственной близости – главная привлекательная особенность этой модели.

В поддержку идеи о том, что структурные изменения хромосом являются результатом недостаточности RecA / Rad51, является наблюдение, что дрозофила, в которой была удалена одна копия гена, гомологичного RAD51 , дает смесь гомологичных и негомологичных соединений при репарации двойных соединений. разрывы нитей ¹⁰⁷ . Постулируется, что RecA / Rad51 подавляется, когда происходит MMBIR, потому что клетки находятся в состоянии стресса. Есть две линии доказательств, подтверждающих эту концепцию.Во-первых, гипоксический стресс в линиях раковых клеток человека приводит к репрессии RAD51 и снижению гомологичной рекомбинации (обзор ^{108 , 109 , 121} ). Это было интерпретировано как переход от высокоточного HR к более низкому NHEJ, вызванному стрессом ¹¹⁰ . Однако в случае свернутой вилки репликации NHEJ невозможен, потому что есть только один конец. Таким образом, мы предполагаем, что такое переключение в репарации двухцепочечных концов приведет к основанному на BIR механизму, такому как MMBIR.Известно, что гипоксия вызывает амплификацию генов в линиях раковых клеток путем активации хрупких сайтов, ведущих к DSB ¹¹¹ , которые также активируются ингибированием синтеза ДНК ⁸⁵ , предположительно приводя к образованию одинарных двухцепочечных концов. Во-вторых, амплификация в E. coli , которая включает образование микрогомологических соединений, обсуждаемых выше ^{100 , 101} , вызывается стрессом голодания. Это демонстрируется наблюдением, что амплификация не начинается до тех пор, пока клетки не голодны ¹¹² , и что для этого требуется индукция общей реакции на стресс и голодание с помощью активатора транскрипции RpoS ¹¹³ .Однако не было показано, что это связано с подавлением гена recA .

Другой переход от высокоточной к подверженной ошибкам репарации двухцепочечных разрывов, наблюдаемый в голодной E. coli , зависит от экспрессии основного общего стрессового ответа клеток ¹¹⁴ . Даже искусственно вызывая стрессовую реакцию в отсутствие стресса, этот переключатель вызывает ¹¹⁴ .

Поскольку во время BIR любой гомолог может быть скопирован, модель MMBIR ясно предсказывает, что структурные изменения часто будут сопровождаться обширным LOH, а в некоторых случаях потерей импринтинга ²⁴ .Сообщалось о многих случаях делеций, связанных с обширным LOH, в клетках пациентов с острым лимфобластным лейкозом ¹¹⁵ .

Как описано, механизмы как концевого соединения, так и MMBIR могут показывать микрогомологические соединения и вставку других последовательностей на стыке, так что мы еще не знаем диагностический критерий, по которому их можно различить постфактум, хотя наличие сложности возможно. более характерен для MMBIR, чем для NHEJ. Поскольку большинство вставок в конечных точках представляют собой вставки соседней последовательности, поскольку существует обширное и растущее свидетельство того, что репликация играет роль в генерации неповторяющихся CNV, и поскольку ожидается, что односторонние DSB будут гораздо более распространены, чем двухсторонние. завершенные DSB, мы отдаем предпочтение таким механизмам, как MMBIR, а не механизмам соединения концов, поскольку они ответственны за большую часть неповторяющихся генераций CNV.Это особенно верно для дупликаций, троек и сложных перестановок.

Влияние архитектуры хромосомы на CNV

CNV не распределены случайным образом в геноме человека, но имеют тенденцию группироваться в областях сложной геномной архитектуры, состоящей из сложных паттернов прямых и инвертированных LCR, как показано на. Некоторые из этих кластеров могут быть связаны с отсутствием чувствительных к дозировке генов в некоторых регионах, но есть достаточно доказательств того, что специфические архитектурные особенности хромосом также задействованы.

Наиболее очевидный эффект архитектуры состоит в том, что изменения, опосредованные NAHR, происходят там, где есть уже существующие LCR, которые обеспечивают гомологию, необходимую для рекомбинации (обсуждалось выше). Более тонкие влияния – это преимущественное возникновение вариации числа копий в областях гетерохроматина вблизи теломер ^{116 , 117} и центромер ^{118 – 120} , ассоциация со структурами, специфичными для последовательности, такими как точки начала репликации и т. Д. терминаторы ⁵⁴ и последовательности прикрепления каркаса ^{27 , 121} , возникновение неповторяющихся изменений в регионах, несущих множественные LCR ^{26 , 33} , включая инвертированные повторы и палиндромные последовательности (проверено ⁷⁸ ), а также роль многократно повторяющихся последовательностей LINES и SINES в создании структурных изменений ¹²² .Способность последовательностей ДНК принимать конформацию, отличную от B, например крестообразную, влияет на структурные изменения хромосом способом, который зависит от структур, а не от конкретных последовательностей, которые их генерируют ^{123 – 125} . Наконец, есть отчеты о конкретных согласованных последовательностях, связанных с CNV ^{30 , 100 , 121 , 126} . Преимущественное возникновение разовых структурных изменений вблизи LCR было признано в течение некоторого времени ^{33 , 34 , 127} .Это было объяснено как тенденция вторичных структур в ДНК вызывать остановку репликационной вилки ²⁶ , а также обеспечивать одноцепочечные области, которые могут способствовать образованию микрогомологических соединений ²⁴ . SINE, преимущественно последовательности Alu, , и LINE представляют собой ретротранспозоны, на которые приходится значительная часть генома человека. Эти элементы вызывают мутацию путем вставки в кодирующие последовательности, вызывают CNV посредством NAHR, а также обеспечивают фокус для неповторяющихся изменений в копийном номере ¹²⁸ способом, который непонятен.Например, одно исследование обнаружило элементов Alu в 13 из 40 конечных точек делеции микрогомологии ¹²² . Связь LINE и SINE с CNV может быть вызвана либо частым разрывом ДНК в этих областях (например, из-за активности живых транспозонов), что может инициировать негомологичную рекомбинацию, либо устойчивой одноцепочечностью в этих областях (из-за обширная транскрипция, вторичные структуры или пауза репликации), что может сделать их предпочтительными сайтами для отжига однонитевых концов ДНК.

Таким образом, можно сделать вывод, что изменения количества копий не распределяются случайным образом, но что множественные геномные особенности могут влиять на вероятность их появления. Подробные механистические объяснения влияния этих архитектурных характеристик на формирование CNV ждут дальнейшей работы.

Выводы и разветвления

Существует по крайней мере два основных механизма изменения количества копий: NAHR и события, опосредованные микрогомологией. NAHR может быть образован либо классической HR-опосредованной репарацией DSB через двойное соединение Холлидея, либо из BIR, который перезапускает сломанные репликационные вилки с помощью HR.Однако LCR, которые опосредуют NAHR, предположительно были сформированы преимущественно с помощью того же механизма, что и единовременные изменения числа копий, которые формируются сейчас. Таким образом, механизмы изменения числа копий, опосредованного микрогомологией, лежат в основе большинства изменений числа копий. Основываясь на доказательствах в пользу репликативных механизмов, известной энзимологии трансакций ДНК в модельных организмах, а также на доказательствах, представленных выше, относительно потенциального участия стрессовых реакций в изменении доступности белков репарации ДНК, мы предполагаем, что такой механизм, как MMBIR, в настоящее время является нашим лучшим. рабочая гипотеза для большинства случаев изменения количества копий.Также вероятно, что механизмы соединения концов, включая NHEJ, MMEJ и SSA, будут играть роль, особенно в клетках иммунной системы. Было показано, что цикл разрыва-слияния-моста работает в экспериментальных системах и, по-видимому, важен для амплификации при некоторых видах рака. Однако нам не нужно предполагать, что в каждом конкретном событии действует только один механизм. События, опосредованные микрогомологией, могут запускать цикл разрыва-слияния-моста путем формирования дицентрической хромосомы, которая в конечном итоге должна быть преобразована в более стабильный генотип.Это также может произойти, когда NAHR вызывает образование дицентрической хромосомы. Точно так же механизмы соединения концов могут сыграть роль в устранении незакрепленных концов, возникающих в результате других событий. Примечательно, что этап слияния цикла разрыва-слияния-моста может быть опосредован любым из этих механизмов соединения концов.

Молекулярные события, предложенные в MMBIR, экспериментально не продемонстрированы. Из-за ее молекулярных деталей можно проверить несколько аспектов модели. Предполагаемое участие стрессовых реакций также будет важно проверить.Потенциал обширного LOH ниже по течению от инициирующего события уже был замечен в некоторых системах, и дальнейшее тестирование этой корреляции должно быть доступно при изучении данных по однонуклеотидному полиморфизму в масштабе всего генома. Этот LOH может простираться до следующей репликационной вилки, движущейся в противоположном направлении, или он может обрабатывать теломеры.

Если можно доказать, что CNV возникает в результате стрессовой реакции, это имеет интересные последствия для физиологии, эволюции и болезней.Во-первых, индуцируемая стрессом структурная изменчивость хромосом предполагает, что клетки обладают индуцируемой способностью к эволюции («эволюционируемостью»). Если этот механизм действительно индуцируется стрессом, то клетки и организмы будут предрасположены к перестройке генома, когда они подвергаются стрессу, и активируют стрессовые реакции. Это особенно важно, когда они плохо приспособлены к окружающей среде. Если стресс подпитывает формирование CNV, то генерирование генетического разнообразия, на которое действует естественный отбор, будет максимальным именно тогда, когда популяция получит наибольшую выгоду от такого разнообразия, потенциально подпитывая эволюцию в то время.Эта идея была разработана для объяснения мутагенеза, влияющего на эволюцию бактериальных популяций (обзор ^{129 , 130} ), включая формирование устойчивости к антибиотикам при воздействии антибиотиков ^{131 , 132} . Если индуцируемость стресса применима к образованию CNV, то CNVs могут быть не только важными промоторами эволюционной дивергенции ¹² , но, кроме того, их образование может быть механизмом усиления «эволюционируемости». Хотя клетки человека демонстрируют индуцируемые стрессом генетические изменения ^{109 , 133 , 134} , ни в одном организме с дифференцированной зародышевой линией еще не известно, могут ли такие индуцируемые стрессом механизмы нестабильности генома вносить вклад в зародышевую линию. и так с эволюцией.Это важная тема для будущих исследований.

Во-вторых, аналогичным образом предсказанное возникновение LOH с образованием CNV, вероятно, будет важным при раке человека, при котором как мутации, так и LOH приводят к прогрессированию опухоли и устойчивости к терапии. Тот же механизм предлагается для создания транслокаций, когда микрогомология, используемая при репарации, находится в другой хромосоме ²⁴ , что еще больше усугубляет проблему. Проблема индуцируемого стрессом развития рака и механизмов резистентности обсуждается в другом месте ^{108 , 129} .

В-третьих, учитывая большое и постоянно увеличивающееся число онтогенетических, неврологических и психиатрических синдромов, связанных с CNV, мы хотим предложить важную аналогию или следствие из биологии рака с этими другими заболеваниями, связанными с CNV. Хорошо известно, что мутации, увеличивающие частоту мутаций, «мутации-мутаторы», способствуют предрасположенности к раку, потому что рак – это генетическое заболевание, подпитываемое мутагенезом и нестабильностью генома ^{135 – 137} . Мутации-мутации распространены у микробов, и многие из них известны при большом разнообразии синдромов предрасположенности к раку и старения ²⁵ .Мы предполагаем, что помимо того, что CNV напрямую стимулируют различные синдромы, будут существовать человеческие варианты с повышенной скоростью изменения CNV из-за мутаций в любом из многих возможных генов, влияющих на обработку и восстановление повреждений ДНК (среди других процессов). Мы ожидаем, что такие аллели будут предрасполагать семьи и отдельных людей к психическим, возрастным, неврологическим и другим синдромам, вызываемым CNV. Дальнейшая работа должна быть направлена ​​на выявление таких мутаций модификатора-локуса, которые влияют на развитие человека и другие нарушения, некоторые из которых, как мы прогнозируем, будут делать это за счет повышения скорости образования CNV.Люди с такими мутациями также могут быть предрасположены к раку. Более того, в случаях, когда заболевание может быть вызвано CNV, представленной в виде мозаики, терапии, направленные на уменьшение генеза CNV, могут снизить пенетрантность такого заболевания. Лекарства, которые делают это, не известны и не разрабатываются. Идентификация многих генов, белков и путей, влияющих на скорость образования CNV, и понимание механизмов их действия являются предпосылками для рассмотрения любых потенциальных терапевтических подходов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения, R01 GM64022 для PJH, R01 NS59529 для J.R.L., R01 GM53158 и R01 CA85777 для SMR и R01 GM80600 для GI.

Сноски

Резюме

• Варианты числа копий (CNV) возникают в результате гомологичной рекомбинации (HR) между повторяющимися последовательностями (повторяющиеся CNV). Или с помощью негомологичных механизмов, которые происходят по всему геному (неповторяющиеся CNV).

• Непериодические CNV часто показывают микрогомологию в конечных точках и могут иметь сложную структуру.

• Частота локус-специфических мутаций для CNV и других структурных изменений на 2–4 порядка больше, чем для точечных мутаций.

• HR-механизмы обычно обеспечивают точную репарацию повреждений ДНК.

• Двухцепочечные разрывы устраняются с помощью HR или механизмов соединения концов, которые обычно негомологичны.

• Сломанные вилки репликации с одинарными двухцепочечными концами также ремонтируются HR.

• Есть свидетельства того, что восстановление сломанных репликационных вилок лежит в основе некоторой негомологичной рекомбинации.

• Ремонт сломанных вилок в стрессированных клетках может вызвать негомологичное восстановление из-за индуцированного стрессом подавления белков HR.

• Представлены модели механизмов, с помощью которых стресс может вызывать негомологичные события, приводящие к CNV.

Ссылки

1. Iafrate AJ, et al. Обнаружение крупномасштабных вариаций в геноме человека. Нат Жене. 2004; 36: 949–951. [PubMed] [Google Scholar] 3. Редон Р. и др. Глобальные вариации числа копий в геноме человека. Природа. 2006; 444: 444–454. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Опрос по массиву SNP и aCGH 270 человек из образцов HapMap человека.4. Sebat J, et al. Полиморфизм крупномасштабного числа копий в геноме человека. Наука. 2004. 305: 525–528. [PubMed] [Google Scholar] 7. Bruder CEG, et al. Фенотипически согласованные и дискордантные монозиготные близнецы демонстрируют разные профили вариаций числа копий ДНК. Am J Hum Genet. 2008; 82: 1–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Piotrowski A, et al. Соматический мозаицизм вариации числа копий в дифференцированных тканях человека. Hum Mutat. 2008. 29: 1118–1124. [PubMed] [Google Scholar] 9. Beckmann JS, Estivill X, Antonarakis SE.Варианты числа копий и генетические признаки: ближе к разрешению фенотипической изменчивости к генотипической. Nat Rev Genet. 2007. 8: 639–646. [PubMed] [Google Scholar] 10. Дюма Л. и др. Вариация числа копий генов, охватывающая 60 миллионов лет эволюции человека и приматов. Genome Res. 2007; 17: 1266–1277. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] В этой статье прослеживается история изменения количества копий в ходе эволюции линии приматов.11. Nahon JL. Рождение «специфических для человека» генов в ходе эволюции приматов.Genetica. 2003. 118: 193–208. [PubMed] [Google Scholar] 12. Бейли Дж. А., Эйхлер Э. Э. Сегментарные дупликации приматов: тигли эволюции, разнообразия и болезней. Nat Rev Genet. 2006. 7: 552–564. [PubMed] [Google Scholar] 13. Станкевич П., Шоу Си-Джей, Холерс М., Иноуэ К., Лупски-младший. Последовательные сегментарные дупликации во время эволюции приматов приводят к сложной архитектуре генома человека. Genome Res. 2004. 14: 2209–2220. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Marques-Bonet T, et al. Вспышка сегментарных дупликаций в геноме предка африканской великой обезьяны.Природа. 2009; 457: 877–881. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 15. Оно С. Эволюция путем дупликации генов. Springer-Verlag; Берлин, Нью-Йорк: 1970. [Google Scholar] 16. Иноуэ К. и др. Молекулярный механизм различных неврологических фенотипов, передаваемых мутациями с усечением аллелей. Нат Жене. 2004; 36: 361–9. [PubMed] [Google Scholar] 17. Rotger M, et al. Частичная делеция CYP2B6 из-за неравного кроссовера с CYP2B7. Pharmacogenet Genomics. 2007. 17: 885–890. [PubMed] [Google Scholar] 18.Чжан Ф., Хаджави М., Таун С.Ф., Коннолли А.М., Батиш С.В., Лупски-младший. Механизм репликации ДНК FoSTeS / MMBIR может генерировать геномные, генные перестройки и перестановки экзонов человека. Генетика природы. 2009 в печати. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Brodeur GM, Хогарти MD. В: Генетические основы рака человека. Фогельштейн Б., Кинзлер К.В., редакторы. Макгроу-Хилл; Нью-Йорк: 1998. С. 161–172. [Google Scholar] 21. Франк Б. и др. Вариант числа копий в гене-кандидате MTUS1-супрессоре опухоли и риск семейного рака молочной железы.Канцерогенез. 2007. 28: 1442–1445. [PubMed] [Google Scholar] 22. Lupski JR. Геномные нарушения: структурные особенности генома могут привести к перестройке ДНК и появлению признаков болезней человека. Тенденции Genet. 1998. 14: 417–422. [PubMed] [Google Scholar] 23. Stranger BE и др. Относительное влияние вариации числа нуклеотидов и копий на фенотипы экспрессии генов. Наука. 2007; 315: 848–853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Гастингс П.Дж., Ира Г., Лупски-младший. Модель репликации, индуцированной микрогомологией, для определения происхождения вариаций числа копий у человека.PLoS Genet. 2009; 5: e1000327. DOI: 10,1371. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] В этом обзоре представлена ​​модель MMBIR для хромосомной перестройки с подробными доказательствами, на которых она основана. Friedberg EC, et al. Ремонт ДНК и мутагенез. АСМ Пресс; Вашингтон, округ Колумбия: 2005. [Google Scholar] 26. Ли Дж. А., Карвалью К. М., Лупски-младший. Механизм репликации ДНК для создания разовых перестроек, связанных с геномными нарушениями. Клетка. 2007. 131: 1235–1247. [PubMed] [Google Scholar] Описание структуры дупликаций, наблюдаемых у пациентов с геномными расстройствами со сложной структурой и микрогомологией.27. Нобиле С.Т., Рицци Л., Симионати Ф., Нигро Б., Кардаццо В., Патарнелло Б., Валле Т., Даниэли Г., А. Г. Анализ 22 точек останова делеции в интроне дистрофина 49. Hum Genet. 2002; 110: 418–421. [PubMed] [Google Scholar] 28. Карвалью CM и др. Сложные перестройки у пациентов с дупликациями MECP2 могут происходить за счет остановки вилки и переключения шаблона. Hum Mol Genet. 2009 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29. Чен Дж. М., Чужанова Н., Стенсон П. Д., Ферек С., Купер Д. Н.. Внутрихромосомное проскальзывание серийной репликации в транс приводит к разнообразным геномным перестройкам, включающим инверсии.Hum Mutat. 2005. 26: 362–373. [PubMed] [Google Scholar] 30. Gajecka M, et al. Неожиданная сложность на стыках точек разрыва у фенотипически нормальных индивидуумов и механизмов, участвующих в генерации сбалансированных транслокаций t (1; 22) (p36; q13) Genome Res. 2008; 18: 1733–1742. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Sheen CR, et al. Двойные комплексные мутации с участием F8 и FUNDC2, вызванные репликацией, индуцированной отдельным разрывом. Hum Mutat. 2007; 28: 1198–2006. [PubMed] [Google Scholar] 32. Vissers LE, et al.Сложные перестройки хромосомы 17p, связанные с низкокопийными повторами у двух пациентов с врожденными аномалиями. Hum Genet. 2007; 121: 697–709. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 34. Ли Дж. А. и др. Роль геномной архитектуры в дупликации PLP1, вызывающей болезнь Пелицея-Мерцбахера. Hum Mol Genet. 2006. 15: 2250–2265. [PubMed] [Google Scholar] 35. Ли Дж. А. и др. Спастическая параплегия типа 2, связанная с аксональной невропатией и очевидным эффектом положения PLP1. Энн Нейрол. 2006; 59: 398–403. [PubMed] [Google Scholar] 36.Ловетт С.Т., Херли Р.Л., Сутера В.А., мл., Обюшон Р.Х., Лебедева М.А. Переход между областями ограниченной гомологии в Escherichia coli . RecA-зависимые и RecA-независимые пути. Генетика. 2002; 160: 851–859. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Лискай Р.М., Лецу А., Стачелек Дж. Требование гомологии для эффективного преобразования генов между дублированными хромосомными последовательностями в клетках млекопитающих. Генетика. 1987. 115: 161–167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Reiter LT, et al.Продукты мейотической рекомбинации человека, выявленные путем секвенирования «горячей точки» для обмена гомологичной цепью у пациентов с множественной делецией HNPP. Am J Hum Genet. 1998. 62: 1023–1033. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Станкевич П., Лупски-младший. Архитектура генома, перестройки и геномные нарушения. Тенденции Genet. 2002; 18: 74–82. [PubMed] [Google Scholar] 40. Krogh BO, Symington LS. Рекомбинация белков в дрожжах. Анну Рев Жене. 2004. 38: 233–271. [PubMed] [Google Scholar] 41. Pâques F, Haber JE.Множественные пути рекомбинации, индуцированные двухцепочечными разрывами у Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev.1999; 63: 349-404. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 42. Эспозито MS. Доказательства того, что спонтанная митотическая рекомбинация происходит на двухцепочечной стадии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1978; 75: 4436–4440. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 43. Старк Дж. М., Джасин М. Обширная потеря гетерозиготности подавляется во время гомологичной репарации хромосомных разрывов. Mol Cell Biol. 2003; 23: 733–743.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Дюпень П. и др. Активность геликазы Srs2 стимулируется филаментами Rad51 на дцДНК: влияние на частоту кроссовера во время митотической рекомбинации. Mol Cell. 2008. 29: 243–254. [PubMed] [Google Scholar] 45. Sun W и др. Ортолог FANCM Fml1 способствует рекомбинации на остановившихся ответвлениях репликации и ограничивает кроссинговер во время репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Mol Cell. 2008. 32: 118–128. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 46. Ира Г., Малкова А., Либери Г., Фойани М., Хабер Дж. Э.Srs2 и Sgs1-Top3 подавляют кроссоверы во время репарации двухцепочечных разрывов в дрожжах. Клетка. 2003. 115: 401–411. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 47. Пракаш Р. и др. Геликаза Mph2 дрожжей диссоциирует образуемые Rad51 D-петли: значение для контроля кроссовера в митотической рекомбинации. Genes Dev. 2009; 23: 67–79. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 48. Ву Л., Хиксон ИД. Хеликаза синдрома Блума подавляет кроссинговер во время гомологичной рекомбинации. Природа. 2003. 426: 870–874. [PubMed] [Google Scholar] 49.Прадо Ф., Кортес-Ледесма Ф., Уэртас П., Агилера А. Митотическая рекомбинация в Saccharomyces cerevisiae. Курр Жене. 2003. 42: 185–198. [PubMed] [Google Scholar] 50. Смит CE, Llorente B, Symington LS. Переключение матрицы во время репликации, вызванной разрывом. Природа. 2007. 447: 102–105. [PubMed] [Google Scholar] В этой статье показаны экспериментальные данные дрожжей о природе BIR, в частности, показано переключение шаблона между гомологами, а иногда и с негомологичными хромосомами, вызывающими транслокацию, а затем демонстрирующими репликацию на теломеры.51. Bauters M, et al. Непериодические дупликации MECP2, опосредованные разрывами ДНК, управляемыми геномной архитектурой, и репарацией репликации, индуцированной разрывом. Genome Res. 2008. 18: 847–858. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52. Deem A, et al. Дефектная репликация, индуцированная разрывом, приводит к половинным кроссоверам у Saccharomyces cerevisiae. Генетика. 2008; 179: 1845–1860. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 53. Нараянан В, Лобачев К.С. Внутрихромосомная амплификация гена, запускаемая разрывами, покрытыми шпилькой, требует гомологичной рекомбинации и не зависит от негомологичного соединения концов.Клеточный цикл. 2007; 6: 1814–1818. [PubMed] [Google Scholar] 54. Payen C, Koszul R, Dujon B, Fischer G. Сегментарные дупликации возникают в результате Pol32-зависимой репарации сломанных вилок посредством двух альтернативных механизмов, основанных на репликации. PLoS Genet. 2008; 4: e1000175. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Данные дрожжей о том, что LCR возникают по репликативному механизму, в частности с участием BIR.55. Шмидт К.Х., Ву Дж., Колоднер Р.Д. Контроль транслокаций между сильно дивергированными генами с помощью Sgs1, гомолога Saccharomyces cerevisiae белка синдрома Блума.Mol Cell Biol. 2006; 26: 5406–5420. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 56. Лин Ф.Л., Сперле К., Штернберг Н. Модель гомологичной рекомбинации во время переноса ДНК в L-клетки мыши: роль концов ДНК в процессе рекомбинации. Mol Cell Biol. 1984; 4: 1020–1034. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Свейгерт С.Е., Кэрролл Д. Ремонт и рекомбинация рентгеновских плазмид в ооцитах Xenopus laevis. Mol Cell Biol. 1990; 10: 5849–56. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 58.Haber JE. Изучение путей гомологичной рекомбинации. Curr Opin Cell Biol. 1992; 4: 401–412. [PubMed] [Google Scholar] 59. Эллиотт Б., Ричардсон С., Джасин М. Механизмы хромосомной транслокации на интронных элементах алюминия в клетках млекопитающих. Mol Cell. 2005; 17: 885–94. [PubMed] [Google Scholar] 60. Rayssiguier C, Thaler DS, Radman M. Барьер для рекомбинации между Escherichia coli и Salmonella typhimurium нарушен у мутантов с репарацией ошибочного спаривания. Природа. 1989; 342: 396–401.[PubMed] [Google Scholar] 61. Unal E, et al. Путь ответа на повреждение ДНК использует модификацию гистона для сборки когезинового домена, специфичного для двухцепочечного разрыва. Mol Cell. 2004; 16: 991–1002. [PubMed] [Google Scholar] 62. Strom L, Lindroos HB, Shirahige K, Sjogren C. Пострепликативное привлечение когезина к двухцепочечным разрывам необходимо для репарации ДНК. Mol Cell. 2004. 16: 1003–1015. [PubMed] [Google Scholar] 63. Ким Дж. С., Красиева Т. Б., ЛаМорте В., Тейлор А. М., Йокомори К. Специфическое привлечение когезина человека к лазерно-индуцированному повреждению ДНК.J Biol Chem. 2002; 277: 45149–45153. [PubMed] [Google Scholar] 64. Sjogren C, Nasmyth K. Сцепление сестринских хроматид требуется для пострепликативной репарации двухцепочечных разрывов у Saccharomyces cerevisiae. Curr Biol. 2001; 11: 991–995. [PubMed] [Google Scholar] 65. Кобаяши Т., Хориучи Т., Тонгаонкар П., Ву Л., Номура М. SIR2 регулирует рекомбинацию между различными повторами рДНК, но не рекомбинацию внутри отдельных генов рРНК в дрожжах. Клетка. 2004. 117: 441–453. [PubMed] [Google Scholar] 66. Кобаяши Т., Гэнли А.Р.Регуляция рекомбинации посредством индуцированной транскрипцией диссоциации когезина в повторах рДНК. Наука. 2005; 309: 1581–1584. [PubMed] [Google Scholar] 67. Kaye JA и др. Разрывы ДНК способствуют нестабильности генома, препятствуя правильной сегрегации хромосом. Curr Biol. 2004. 14: 2096–2106. [PubMed] [Google Scholar] 69. О, SD и др. Ортолог BLM, Sgs1, предотвращает аберрантный кроссинговер, подавляя образование мультихроматидных совместных молекул. Клетка. 2007. 130: 259–272. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70.Jain S, et al. Контрольная точка выполнения рекомбинации регулирует выбор пути гомологичной рекомбинации во время репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Genes Dev. 2009; 23: 291–303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 71. Маквей М., Ли С.Е. Ремонт двухцепочечных разрывов MMEJ (режиссерский разрез): удаленные последовательности и альтернативные окончания. Тенденции Genet. 2008. 24: 529–538. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 72. Либер MR. Механизм соединения концов негомологической ДНК человека. J Biol Chem. 2008; 283: 1–5.[PubMed] [Google Scholar] 73. Дейли Дж. М., Палмбос П. Л., Ву Д., Уилсон Т. Е.. Негомологичное соединение концов у дрожжей. Анну Рев Жене. 2005; 39: 431–451. [PubMed] [Google Scholar] 74. Хавив-Чеснер А., Кобаяши Ю., Габриэль А., Купец М. Захват линейных фрагментов при двухцепочечном разрыве в дрожжах. Nucleic Acids Res. 2007. 35: 5192–5202. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Yu X, Gabriel A. Ku-зависимые и Ku-независимые пути соединения концов приводят к хромосомным перестройкам во время репарации двухцепочечных разрывов у Saccharomyces cerevisiae.Генетика. 2003; 163: 843–856. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 77. МакКлинток Б. Хромосомная организация и генная экспрессия. Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 1951; 16: 13–47. [PubMed] [Google Scholar] 78. Танака Х., Яо МС. Амплификация палиндромного гена – эволюционно законсервированная роль инвертированных повторов ДНК в геноме. Нат Рев Рак. 2009; 9: 216–224. [PubMed] [Google Scholar] 79. Танака Х., Бергстром Д.А., Яо М.С., Тапскотт С.Дж. Крупные палиндромы ДНК как распространенная форма структурных хромосомных аберраций при раке человека.Hum Cell. 2006; 19: 17–23. [PubMed] [Google Scholar] 80. Coquelle A, Pipiras E, Toledo F, Buttin G, Debatisse M. Экспрессия хрупких сайтов запускает внутрихромосомную амплификацию генов млекопитающих и устанавливает границы для ранних ампликонов. Клетка. 1997. 89: 215–225. [PubMed] [Google Scholar] 81. Шоу CJ, Lupski JR. Неповторяющиеся делеции 17p11.2 генерируются гомологичными и негомологичными механизмами. Hum Genet. 2005; 116: 1–7. [PubMed] [Google Scholar] 82. Арльт М.Ф. и др. Стресс репликации вызывает изменения числа копий по всему геному в человеческих клетках, которые напоминают полиморфные и патогенные варианты.Am J Hum Genet. 2009 г. DOI: 10.1016 / j.ajhg.2009.01.024. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 83. Дуркин С.Г., и др. Стресс репликации вызывает опухолевидные микроделеции в FHIT / FRA3B. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2008; 105: 246–251. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 84. Kuo MT, Vyas RC, Jiang LX, Hittelman WN. Разрыв хромосомы в основном уязвимом участке, связанный с амплификацией гена Р-гликопротеина в клетках СНО с множественной лекарственной устойчивостью. Mol Cell Biol. 1994; 14: 5202–5211. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85.Coquelle A, Rozier L, Dutrillaux B, Debatisse M. Индукция множественных двухцепочечных разрывов в hsr за счет экспрессии мегануклеазы I-SceI или активации хрупкого сайта приводит к образованию двойных минут и другим хромосомным перестройкам. Онкоген. 2002; 21: 7671–7679. [PubMed] [Google Scholar] 87. Альбертини А.М., Хофер М., Калос М.П., ​​Миллер Дж. Х. О формировании спонтанных делеций: важность гомологии коротких последовательностей в генерации больших делеций. Клетка. 1982; 29: 319–328. [PubMed] [Google Scholar] 88.Farabaugh PJ, Schmeissner U, Hofer M, Miller JH. Генетические исследования lac-репрессора. VII. О молекулярной природе спонтанных горячих точек в гене lacI Escherichia coli. J Mol Biol. 1978; 126: 847–857. [PubMed] [Google Scholar] 89. Икеда Х., Симидзу Х., Укита Т., Кумагаи М. Новый тест на незаконную рекомбинацию в Escherichia coli : стимуляция образования лямбда-биотрансдуцирующего фага ультрафиолетовым светом и его независимость от функции RecA. Adv Biophys. 1995. 31: 197–208.[PubMed] [Google Scholar] 90. Shimizu H, et al. Независящая от короткой гомологии незаконная рекомбинация в Escherichia coli : механизм, отличный от незаконной рекомбинации, зависимой от короткой гомологии. J Mol Biol. 1997. 266: 297–305. [PubMed] [Google Scholar] 91. Би Х, Лю Л.Ф. recA -независимая и recA -зависимая внутримолекулярная рекомбинация плазмид: дифференциальная гомология, потребность и эффект расстояния. J Mol Biol. 1994; 235: 414–423. [PubMed] [Google Scholar] 92.Мазин А.В., Кузьминов А.В., Дианов Г.Л., Салганик Р.И. Механизмы образования делеций в плазмидах Escherichia coli. II. Делеции опосредованы короткими прямыми повторами. Mol Gen Genet. 1991; 228: 209–214. [PubMed] [Google Scholar] 93. Chedin F, Dervyn E, Dervyn R, Ehrlich SD, Noirot P. Частота образования делеций уменьшается экспоненциально с увеличением расстояния между короткими прямыми повторами. Mol Microbiol. 1994; 12: 561–569. [PubMed] [Google Scholar] 94. Ловетт С.Т., Глюкман Т.Дж., Саймон П.Дж., Сутера В.А., младший, Драпкин П.Т. Рекомбинация между повторами в Escherichia coli с помощью recA -независимого, чувствительного к близости механизма.Mol Gen Genet. 1994; 254: 294–300. [PubMed] [Google Scholar] 95. Bierne H, Vilette D, Ehrlich SD, Michel B. Выделение мутации dnaE , которая усиливает RecA-независимую гомологичную рекомбинацию в хромосоме Escherichia coli . Mol Microbiol. 1997; 24: 1225–1234. [PubMed] [Google Scholar] 97. Бзымек М, Ловетт СТ. Нестабильность повторяющихся последовательностей ДНК: роль репликации во многих механизмах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2001; 98: 8319–8325. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 98.Ловетт С.Т., Фещенко В.В. Стабилизация расходящихся тандемных повторов путем репарации ошибочного спаривания: свидетельство образования делеции через неправильно выровненный промежуточный продукт репликации. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 7120–7124. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 100. Slack A, Thornton PC, Magner DB, Rosenberg SM, Hastings PJ. О механизме амплификации гена, индуцированной при стрессе у Escherichia coli . PLoS Genetics. 2006; 2: e48. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Экспериментальные данные из Escherichia coli , предполагающие, что структурные изменения хромосомы происходят по репликативному механизму, а также показывающие, что характеристики амплификации в E, coli аналогичны характеристикам не -рецидивирующие изменения геномной болезни человека.101. Кугельберг Э., Кофоид Э., Реамс А.Б., Андерссон Д.И., Рот-младший. Множественные пути амплификации выбранного гена во время адаптивной мутации. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103: 17319–17324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 103. Бзымек М, Савесон CJ, Фещенко В.В., Ловетт СТ. Сдвинутые механизмы несовпадения с образованием делеций: in vivo, чувствительность к нуклеазам. J Bacteriol. 1999; 181: 477–482. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 104. Lydeard JR, Jain S, Yamaguchi M, Haber JE.Вызванная разрывом репликация и теломеразонезависимое поддержание теломер требуют Pol32. Природа. 2007; 448: 820–823. [PubMed] [Google Scholar] 105. VanHulle K и др. Инвертированная ДНК повторяет репарацию каналов отдаленных двухцепочечных разрывов в слияниях хроматид и хромосомных перестройках. Mol Cell Biol. 2007. 27: 2601–2614. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 107. МакВей М, Адамс М, Стаева-Виейра Э, Секельски Дж. Доказательства множественных циклов инвазии цепей во время восстановления двухцепочечных разрывов у Drosophila.Генетика. 2004. 167: 699–705. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 108. Биндра Р.С., Кросби М.Э., Глейзер П.М. Регуляция репарации ДНК в гипоксических раковых клетках. Раковые метастазы Ред. 2007; 26: 249–260. [PubMed] [Google Scholar] 109. Хуан Л.Е., Биндра Р.С., Глейзер П.М., Харрис А.Л. Генетическая нестабильность, вызванная гипоксией – рассчитанный механизм, лежащий в основе прогрессирования опухоли. J Mol Med. 2007. 85: 139–148. [PubMed] [Google Scholar] 110. Биндра Р.С., Глейзер П.М. Репрессия экспрессии гена RAD51 комплексами E2F4 / p130 при гипоксии.Онкоген. 2007; 26: 2048–2057. [PubMed] [Google Scholar] 111. Coquelle A, Toledo F, Stern S, Bieth A, Debatisse M. Новая роль гипоксии в прогрессировании опухоли: индукция хрупкого сайта, запускающего геномные перестройки и образование сложных DM и HSR. Mol Cell. 1998. 2: 259–265. [PubMed] [Google Scholar] 112. Гастингс П.Дж., Бык Г.Дж., Кламп Дж.Р., Розенберг С.М. Адаптивная амплификация: механизм индуцибельной хромосомной нестабильности. Клетка. 2000; 103: 723–731. [PubMed] [Google Scholar] 113. Ломбардо MJ, Aponyi I, Rosenberg SM.Регулятор общего стрессового ответа RpoS в адаптивной мутации и амплификации в Escherichia coli . Генетика. 2004. 166: 669–680. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 114. Пондер Р.Г., Фонвиль NC, Розенберг С.М. В основе стресс-индуцированной мутации лежит переключение от высокоточной к подверженной ошибкам репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Mol Cell. 2005; 19: 791–804. [PubMed] [Google Scholar] 115. Маллиган CG, et al. Полногеномный анализ генетических изменений при остром лимфобластном лейкозе. Природа.2007. 446: 758–764. [PubMed] [Google Scholar] 116. Шао Л. и др. Идентификация хромосомных аномалий в субтеломерных областях с помощью анализа микрочипов: исследование 5380 случаев. Am J Med Genet A. 2008; 146A: 2242–2251. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 117. Яценко С.А. и др. Молекулярные механизмы субтеломерных перестроек, связанных с синдромом микроделеции 9q34.3. Hum Mol Genet. 2009 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 118. Чжан Л., Лу Х. Х., Чун Вай, Ян Дж., Ли У.Паттерны сегментарной дупликации в геноме человека. Mol Biol Evol. 2005. 22: 135–141. [PubMed] [Google Scholar] 119. Она X и др. Структура и эволюция центромерных переходных областей в геноме человека. Природа. 2004; 430: 857–864. [PubMed] [Google Scholar] 121. Visser R, et al. Идентификация основной горячей точки рекомбинации размером 3,0 т.п.н. у пациентов с синдромом Сотоса, которые несут обычную микроделецию размером 1,9 МП. Am J Hum Genet. 2005. 76: 52–67. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 122.де Смит А.Дж. и др. Варианты с малой делецией имеют стабильные точки останова, обычно связанные с элементами alu. PLoS ONE. 2008; 3: e3104. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 123. Bacolla A, et al. Точки разрыва грубых делеций совпадают с конформациями ДНК, отличными от B. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 14162–14167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 124. Баколла А., Войцеховская М., Космидер Б., Ларсон Дж. Э., Уэллс Р. Д.. Участие структур ДНК, отличных от B, в грубых хромосомных перестройках.Ремонт ДНК (Amst) 2006; 5: 1161–1170. [PubMed] [Google Scholar] 125. Инагаки Х. и др. Хромосомная нестабильность, опосредованная не-B ДНК: крестообразная конформация, а не последовательность ДНК, ответственна за повторяющуюся транслокацию у людей. Genome Res. 2009; 19: 191–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 126. Майерс С., Фриман С., Аутон А., Доннелли П., Маквин Г. Общий мотив последовательности, связанный с горячими точками рекомбинации и нестабильностью генома у людей. Нат Жене. 2008; 40: 1124–9. [PubMed] [Google Scholar] 127.Шоу CJ, Lupski JR. Последствия архитектуры генома человека для расстройств, связанных с перестройкой: геномная основа болезни. Hum Mol Genet. 2004; 13 (спец. № 1): Р57–64. [PubMed] [Google Scholar] 129. Гальхардо Р.С., Гастингс П.Дж., Розенберг С.М. Мутация как реакция на стресс и регуляция эволюционируемости. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2007. 42: 399–435. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Широкий обзор мутации, вызванной стрессом, и ее значения для эволюции.130. Розенберг С.М. Ответная эволюция: адаптивная мутация.Природа Rev Genet. 2001; 2: 504–515. [PubMed] [Google Scholar] 132. Ризенфельд К., Эверетт М., Пиддок Л.Дж., Холл Б.Г. Адаптивные мутации вызывают устойчивость к ципрофлоксацину. Антимикробные агенты Chemother. 1997; 41: 2059–60. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 133. Bindra RSS и др. Подавление Rad51 и снижение гомологичной рекомбинации в гипоксических раковых клетках. Mol Cell Biol. 2004. 24: 8504–8518. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Эта статья показывает, что ферменты гомологичной рекомбинации подавляются стрессом в человеческих клетках, и что это сопровождается снижением ЧСС.134. Михайлова В. Т. и др. Снижение экспрессии гена репарации ошибочного спаривания ДНК Mlh2 в условиях гипоксического стресса в клетках млекопитающих. Mol Cell Biol. 2003. 23: 3265–3273. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 135. Колоднер Р.Д. и соавт. Зародышевые мутации msh6 в семьях колоректального рака. Cancer Res. 1999; 59: 5068–5074. [PubMed] [Google Scholar] 136. Loeb LA. Мутаторный фенотип может потребоваться для многоступенчатого канцерогенеза. Cancer Res. 1991; 51: 3075–3079. [PubMed] [Google Scholar] 137. Модрич П.Исправление несоответствий, генетическая стабильность и предотвращение опухолей. Фил Транс Р. Соц Лондон Б. 1995; 347: 89–95. [PubMed] [Google Scholar] 138. Nguyen DQ и др. В эволюции вариантов числа копий человека сниженный очищающий отбор преобладает над положительным отбором. Genome Res. 2008; 18: 1711–1723. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 140. Gonzalez E, et al. Влияние сегментарных дупликаций, содержащих ген CCL3L1, на восприимчивость к ВИЧ-1 / СПИДу. Наука. 2005; 307: 1434–1440. [PubMed] [Google Scholar] 141.Хиггс Д. Р. и др. Обзор молекулярной генетики кластера генов альфа-глобина человека. Кровь. 1989. 73: 1081–1104. [PubMed] [Google Scholar] 142. Нозава М., Кавахара Ю., Ней М. Геномный дрейф и изменение числа копий генов сенсорных рецепторов у людей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 20421–20426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 143. Якобссон М. и др. Генотип, гаплотип и изменение числа копий в человеческих популяциях во всем мире. Природа. 2008; 451: 998–1003. [PubMed] [Google Scholar] 144.Локк Д.П. и др. Неравновесие по сцеплению и наследуемость полиморфизмов числа копий в дублированных областях генома человека. Am J Hum Genet. 2006. 79: 275–290. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 147. МакКэрролл С.А. и др. Комплексное обнаружение и популяционно-генетический анализ вариабельности SNP и числа копий. Нат Жене. 2008; 40: 1166–1174. [PubMed] [Google Scholar] 148. Тернер DJ и др. Частота мейотических делеций и дупликаций de novo в зародышевой линии, вызывающих несколько геномных нарушений.Нат Жене. 2008; 40: 90–95. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 149. Лам К.В., Джеффрис А.Дж. Процессы изменения числа копий в ДНК человека: динамика делеции гена {альфа} -глобина. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103: 8921–8927. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 150. Лам К.В., Джеффрис А.Дж. Процессы дупликации de novo генов альфа-глобина человека. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 10950–10955. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 152. Лян Кью, Конте Н, Скарнес В.К., Брэдли А.Обширные вариации числа копий генома в эмбриональных стволовых клетках. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2008; 105: 17453–17456. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 153. Lupski JR. Геномные перестройки и спорадические заболевания. Нат Жене. 2007; 39: S43–47. [PubMed] [Google Scholar] 154. van Ommen GJ. Частота изменения количества новых копий у человека. Nature Genet. 2005. 37: 333–334. [PubMed] [Google Scholar] 155. Tuzun E, Bailey JA, Eichler EE. Недавние сегментарные дупликации в сборке рабочего проекта бурой норвежской крысы.Genome Res. 2004. 14: 493–506. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 157. Lovett ST. Закодированные ошибки: мутации и перестройки, опосредованные несовпадением повторяющихся последовательностей ДНК. Mol Microbiol. 2004. 52: 1243–1253. [PubMed] [Google Scholar] Увеличение числа копий

TP53 связано с эволюцией увеличения размеров тела и усилением реакции на повреждение ДНК у слонов

Рецензенты обсудили тот факт, что в процессе рецензирования аналогичная статья была опубликована группой Шиффмана.Однако рецензенты пришли к выводу, что текущая рукопись Сулака и др. содержит значительно больше информации и также делает несколько иные выводы об экспрессии и механизме действия ретрогенов p53. Соответственно, рецензенты согласились рекомендовать представление отредактированной рукописи, которая не только решит некоторые проблемы, связанные с планом эксперимента и анализом данных, но также будет содержать исчерпывающее сравнение и обсуждение результатов, полученных в двух документах.

Мы благодарим редакцию за возможность отредактировать и повторно представить нашу рукопись.

Мы изменили основной текст, в частности разделы «Результаты» и «Обсуждение», чтобы учесть комментарии рецензентов, включая добавление нескольких новых экспериментов, и расширили детали результатов, чтобы прояснить опасения и недоразумения рецензентов. Среди новых экспериментов – демонстрация того, что гены TP53RTG необходимы для усиленного сигнального ответа TP53 у слонов посредством siRNA-опосредованного нокдауна транскриптов TP53RTG, а также подробное структурное и функциональное сравнение нашей модели механизма действия TP53RTG с моделью, предложенной Abegglen et al.(2015). Мы подробно рассмотрим эти дополнительные эксперименты, а также другие изменения ниже.

Основными проблемами, поднятыми рецензентами, являются:

A) Сравнение и обсуждение результатов в текущей рукописи и в статье группы Шиффмана. Рецензенты пришли к выводу, что читателям будет крайне важно четко понимать дополнительную информацию в этой статье, а также области противоречивых наблюдений, которые могут потребовать дальнейшего исследования.В статье Schiffman et al. необходимо процитировать и отметить в текущей рукописи. Рецензенты отметили, что, поскольку этот документ значительно дополняет и расширяет опубликованную работу, он вполне может стать более цитируемым, и что правильная практика цитирования будет заключаться в цитировании обоих из них вместе. Вот несколько примеров аспектов, которые следует сравнивать между двумя документами:

A1) Текущая рукопись содержит элегантную демонстрацию механизма увеличения количества копий посредством сегментарного дублирования, которую следует выделить.Результаты, описанные в первых трех подразделах раздела «Результаты», о филогенетическом происхождении и связи увеличения числа копий с увеличением размера тела, обеспечивают независимую добавленную стоимость, выходящую за рамки Шиффмана.

A2) Некоторые из этих результатов по экспрессии RTG более точны, чем результаты, представленные в Schiffman et al. бумага. Авторам необходимо просмотреть дополнительный материал, а также результаты в опубликованной статье и указать, где они согласны, где нет, и где эти результаты расширяют результаты Schiffman et al.Например, используя RNA-seq, авторы показывают, что ретроген RTG12 является вариантом, наиболее преимущественно транскрибируемым в клетках слона. Напротив, Schiffman et al. использовали ОТ-ПЦР для документирования экспрессии «ретрогенов». Сколько ретрогенов действительно выражено? Возможно ли, что ретрогены экспрессируются специфическим для клеточного типа образом (например, фибробласты в этой статье против лимфобластоидов в статье Шиффмана?).

Приносим извинения за то, что не обратились напрямую к Abegglen et al.(2015) в нашем предыдущем исследовании, хотя мы знали о предстоящем выпуске их рукописи, у нас не было доступа к ней до отправки в eLife (она была опубликована через несколько дней после отправки).

В нашем пересмотренном документе мы посвятили раздел Обсуждения («Сравнение с предыдущими исследованиями слона TP53»), чтобы конкретно сравнить и сопоставить наши результаты с результатами Abegglen et al. (2015). Пока мы сравниваем наши результаты с Abegglen et al. (2015) подробно в пересмотренном Обсуждении, наши основные наблюдения заключаются в следующем: 1) Abegglen et al.(2015) не определили механизмы расширения, в то время как мы, поэтому мы разработали наше обсуждение механизмов дублирования; 2) Abegglen et al. (2015) обнаружили, что клетки слона и человека имеют разную чувствительность к ионизирующей радиации, но выборка их таксонов не позволила поляризовать, какие виды были разными, тогда как наш явный филогенетический подход позволяет нам определить, что у слонов в процессе эволюции повысилась чувствительность к повреждению ДНК; и 3) Abegglen et al. (2015) использовали ОТ-ПЦР и секвенирование по Сэнгеру, чтобы показать, что два различных транскрипта экспрессируются в PBMC слонов, но они не назначили локусы, которым соответствуют эти транскрипты.Мы проанализировали хроматограммы, представленные у Abegglen et al. eFigure 4 и обнаружили, что продукт 185 п.н. является транскриптом гена TP553RTG14, а продукт 201 п.н. является транскриптом гена TP553RTG5. Таким образом, наши объединенные данные предполагают, что транскрибируется по крайней мере пять генов TP53RTG. Кроме того, мы не наблюдали экспрессию TP553RTG14 или TP553RTG5 в жировой ткани, плаценте или фибробластах, что позволяет предположить, что экспрессия некоторых генов TP53RTG тканеспецифична.

B) Неясный механизм действия вариантов p53, кодируемых ретрогеном.Эти две статьи расходятся во мнениях относительно механизма действия белков, кодируемых ретрогенами. Здесь авторы описывают «трансдоминантный» эффект, не связанный с связыванием MDM2. Напротив, работа Schiffman et al. делает вывод, что ретропротеины действительно связываются с MDM2. Данные из обеих статей в этом отношении слабые. Если RTG12 не связывается с MDM2, как указано в этой статье, как тогда его экспрессия контролируется при повреждении ДНК? Каков механизм, с помощью которого УФС приводит к значительно большей экспрессии RTG12? Чтобы решить эту проблему, авторы должны проверить, находится ли индукция RTG12 на уровне РНК или стабильности белка, и определить, индуцирует ли Nutlin (ингибитор взаимодействия MDM2-p53) также накопление белка в этих условиях.Более того, их текущая модель не включает стабилизацию белка RTG12 при повреждении ДНК.

Мы значительно расширили нашу исправленную рукопись и теперь посвящаем раздел результатов, рисунок (рис. 10) и раздел «Обсуждение» сравнению нашей модели с моделью Abegglen et al. (2015) и специально протестируйте нашу и их модели. Хотя эти анализы слишком сложны, чтобы включать их здесь, мы показываем, что: 1) Abegglen et al. (2015) фактически не демонстрируют взаимодействия между TP53RTG9 и MDM2, co-IP, показанный на их eFigure 5C , не имеет полосы с размером, ожидаемым для MDM2 (eFigure 5C, верхняя панель).Нам непонятно, почему они заключают, что MDM2 совпадает с IP-адресом TP53RTG9; 2) Остаток триптофана в TP53, критический для взаимодействия между TP53 и MDM2, заменен на глицин во всех белках TP53RTG; 3) Эта мутация W-> G, по прогнозам, серьезно дестабилизирует взаимодействие TP53RTG / MDM2; и 4) TP53RTG12 не совмещает IP с MDM2. Таким образом, мы заключаем, что Abegglen et al. (2015) модель белков TP53RTG, действующих как ловушки для комплекса MDM, маловероятна.

Напротив, мы показываем, что: 1) домен димеризации TP53 в белках TP53RTG является консервативным; 2) Модель димера TP53 / TP53RTG12 почти неотличима от димера TP53 / TP53; и 3) TP53RTG12 совмещает IP с TP53.Основываясь на этих данных, мы предлагаем модель, в которой белки TP53RTG димеризуются с TP53, тем самым защищая TP53 от комплекса MDM, поскольку комплекс MDM только (эффективно) связывается с тетрамерами TP53. Нам еще предстоит продемонстрировать, как TP53 высвобождается из-за защиты белков TP53RTG, очевидно, что это важная часть нашей модели, но, учитывая объем данной статьи, полагаем, что это лучше оставить в следующей статье.

Однако мы отмечаем, что не предоставляем доказательств того, что экспрессия TP53RTG увеличивается при воздействии УФС.Наш Вестерн-блот демонстрирует полосы ожидаемого размера для TP53RTG12 (и TP53RTG19) из общего белка из клеток, обработанных UVC и ингибитором протеасом MG132. Целью этого эксперимента было выяснить, существуют ли доказательства наличия белков TP53RTG, а не их регуляции путем повреждения ДНК. Таким образом, мы стремились стабилизировать TP53 и предотвратить его деградацию, чтобы мы могли накапливать и потенциально наблюдать белки с низким содержанием. Мы согласны с тем, что важно продемонстрировать, как на уровни экспрессии TP53RTG влияет повреждение ДНК, и является ли это механизмом, высвобождающим TP53 из димеризации TP53RTG.

Как RTG12 в этой рукописи сравнивается с RTG9 в статье Шиффмана и др.? Может ли быть, что различия в предполагаемом связывании с MDM2 между двумя статьями обусловлены вариациями последовательности в N-концевом домене различных ретропротеинов? Чтобы решить эту проблему, обозреватели запрашивают рисунок, на котором показаны аминокислотные и нуклеотидные выравнивания областей трансактивации N-конца для всех RTG, выделены остатки, которые, как известно, важны для трансактивации и связывания с MDM2, и включая все соответствующие идентификаторы Genbank для каждой последовательности.Один из составителей обзора указал, что сайт связывания MDM2 мутирован во всех белках TP53RTG (для тех, которые инициируются на первом ATG). Кроме того, тот же рецензент заметил, что из анализа последовательностей, доступных в Genbank, все TP53RTG, кроме одного, могут продуцировать белок, состоящий по крайней мере из 79 аминокислот, поскольку некоторые TP53RTG могут транслироваться с кодона 728 или 940. Это следует обсудить. в переработанной рукописи.

Мы сравнили последовательность RTG9 от Abegglen et al.(2015) к нашему TP53RTG12 и пришли к выводу, что это один и тот же белок (100% идентичность белков и нуклеотидов). Таким образом, основываясь на нашем пересмотренном анализе связывания MDM2 белками TP53RTG, включая наблюдение, что сайт связывания MDM2 мутирован во всех белках TP53RTG (мы благодарим автора обзора за это очень полезное наблюдение), мы пришли к выводу, что Abegglen et al. (2015) модель не подтверждается текущими данными. Теперь мы включаем панель на рис. 9, показывающую расположение функциональных доменов в белках TP53 и TP53RTG, и логотипы мотива взаимодействия MDM2 и мотива димеризации TP53 в белках TP53 и TP53RTG до высококонсервативных и дивергентных остатков, а также таблицу, которая включает идентификаторы Ensembl. для всех генов TP53RTG.Мы также кратко обсудили альтернативные стартовые сайты для белков TP53RTG в нашем заключительном разделе.

Для дальнейшей поддержки своего «трансдоминантного» механизма авторы должны просто выполнить коиммунопреципитацию полноразмерного белка p53 с использованием C-концевого p53-специфического моноклонального антитела 421 (эпитоп сохраняется в белке p53 слона). Антитело 421 не будет связываться с белками TP53RTG, в которых отсутствует эпитоп 421. Таким образом, коиммунопреципитация белков TP53RTG с полноразмерным белком p53 слона однозначно доказывает образование белкового комплекса с полноразмерным p53.

Это было отличное предложение, и мы очень много месяцев работали над оптимизацией нашего ко-IP и вестернов с помощью антитела 421, однако нам не удалось продемонстрировать, что антитело 421 распознает белок TP53 слона. Хотя этот эксперимент был бы очень информативным, мы, тем не менее, продемонстрировали образование белкового комплекса с полноразмерным человеческим TP53 и Myc-tagged TP53RTG (Рисунок 10J) в поддержку нашей трансдоминантной модели.

Наконец, авт. Предполагают, что белки TP53RTG ингибируют тетрамеризацию p53.Однако тетрамеризация р53 абсолютно необходима для транскрипционной активности р53. Кроме того, MG132, по-видимому, индуцирует убиквитинирование p53 в клетках слона, обработанных агентами, повреждающими ДНК, несмотря на экспрессию TP53RTG12. Следовательно, модель, включающая ингибирование тетрамеризации и убиквитинирования, невозможна. В целом, предлагаемые здесь эксперименты позволят авторам создать более точную модель регуляции p53 ретропротеинами p53 в клетках слона.

MG132 не индуцирует убиквитинирование TP53 в клетках слона, обработанных ДНК-повреждающими агентами, несмотря на экспрессию TP53RTG12, скорее MG132 предотвращает расщепление протеасомой убиквитинированных белков, что приводит к их накоплению.Следовательно, этот эксперимент не может быть использован для определения того, защищают ли белки TP53RTG TP53 от убиквитинирования. Мы отредактировали текст, чтобы прояснить этот момент.

Как могут представить редакторы и рецензенты, мы очень хотим проверить нашу гипотезу «хранителя» и в настоящее время разрабатываем анализ убиквитинирования in vitro, который позволит нам проверить, защищают ли белки TP53RTG TP53 от убиквитинирования, опосредованного MDM2. Хотя эта гипотеза является ключевой частью нашей модели, полная проверка выходит за рамки данной рукописи.Теперь мы предоставляем данные, указывающие, что агенты, повреждающие ДНК, вызывают быстрое и экстремальное снижение транскриптов TP53RTG, предполагая, что подавление TP53RTGs при повреждении ДНК позволяет тетрамеризацию TP53 и инициацию передачи сигналов TP53.

C) Обеспокоенность по поводу использования экспериментов по сверхэкспрессии и клеток HEK293. Авторы обзора были обеспокоены использованием эктопической сверхэкспрессии TP53RTG12 в клетках мыши и клетках человека HEK293. Наблюдаемые фенотипы (например, гиперчувствительность к повреждению ДНК) могут быть связаны с анализом гиперэкспрессии, склонной к артефактам.Кроме того, хорошо установлено, что р53 инактивируется и стабилизируется вирусным трансформирующим белком в клетках HEK293. Таким образом, ценность экспериментов MDM2, проведенных на клетках HEK293, неясна. Чтобы однозначно продемонстрировать, что TP53RTGs регулируют p53-зависимый клеточный ответ на повреждение ДНК, авторы должны подавить эндогенную экспрессию TP53RTG с помощью TP53RTG-специфических siRNAs в клетках слона. Поскольку авторы идентифицировали длинные нуклеотидные последовательности, уникальные для мРНК TP53RTG, тогда становится возможным сконструировать миРНК, которые будут снижать экспрессию TP53RTG, не влияя на экспрессию TP53 в клетках слона.Тогда авторы смогут проверить свою гипотезу на слоновьих клетках. Кроме того, трансфекция миРНК TP53RTG позволила бы авторам однозначно идентифицировать белковые полосы, соответствующие белкам TP53RTG, с помощью вестерн-блоттинга.

Мы согласны с тем, что наиболее убедительной демонстрацией функциональной важности генов TP53RTG было бы подавление или нокаут их экспрессии TP53RTG. Мы пытались подавить экспрессию с помощью многочисленных TP53RTG-специфичных siRNA, нацеленных на различные области транскриптов TP53RTG, до нашей первоначальной заявки.Хотя в этих экспериментах удалось подавить экспрессию TP53RTG, они всегда перекрестно реагировали с TP53, что также приводило к снижению экспрессии TP53.

К счастью, мы недавно идентифицировали полную миРНК TP53RTG, которая снижает экспрессию TP53RTG на ~ 70% и не реагирует перекрестно с TP53. Чтобы проверить функциональность TP53RTG, мы использовали эту миРНК для нокдауна транскриптов TP53RTG и проанализировали индукцию сигнального пути TP53 в ответ на повреждение ДНК и антагонизм MDM2. Мы показываем, что нокдаун TP53RTG в необработанных клетках увеличивал исходную передачу сигналов TP53, в соответствии с нашей моделью «Guardian», а также снижал сигнал TP53 после обработки агентами, вызывающими повреждение ДНК, и Nutlin-3a.Эти данные предполагают, что белки TP53RTG выполняют две различные функции: ингибирование передачи сигналов TP53 в отсутствие индуктивных сигналов и усиление передачи сигналов TP53 после индукции повреждения ДНК.

D) Интерпретация различных «белковых полос», наблюдаемых в клетках слона. В дополнение к экспериментам с siRNA, упомянутым выше, обозреватели отметили, что авторы не могут точно идентифицировать и назвать изоформы p53, наблюдаемые в их экспериментах по электрофорезу. Белок p53 слона не содержит метионина в кодоне 133, а p53psy не обнаружен в клетках слона.Кроме того, полосы выше 50 кДа могут быть полимерами или убиквитинированными белками р53 или полосами перекрестной реакции. Таким образом, важно определить идентичность этих полос с миРНК TP53 (С-концевой участок обеспечит достаточное пространство для последовательностей для конструирования этих миРНК). Кроме того, маркер молекулярной массы белка не отображается ни на одном из иммуноблотов, что препятствует правильной интерпретации этих результатов.

Мы согласны с тем, что данные, подтверждающие трансляцию одного или нескольких генов TP53RTG, являются косвенными, и что вестерн-блоттинг, показанный на рисунке 5E, далек от окончательного.Мы отмечаем, что мы не делаем вывод из этого блоттинга о том, что TP53RTG транслируются, скорее мы заключаем, что мы «идентифицировали слоновью полосу ожидаемого размера для белков TP53RTG12 (19,6 кДа) и TP53RTG19 (22,3 кДа), предполагая, что Транскрипты TP53RTG12 и TP53RTG19 транслируются в фибробластах слона »и прямо заявляют, что мы идентифицировали« высокомолекулярные полосы, соответствующие ранее описанным олигомерам TP53, устойчивым к денатурации SDS (Cohen et al., 2008; Ottaggio et al., 2000) и (поли) убиквитинированные конъюгаты TP53 (Sparks et al., 2013) ».

К сожалению, идентификация антитела, особенно моноклонального, которое распознает слоновьи TP53 и TP53RTG, была чрезвычайно сложной. Однако наше наблюдение, что нокдаун TP53RTGs и сверхэкспрессия TP53RTG12 в клетках мыши имеет функциональные последствия для передачи сигналов TP53, а индукция апоптоза обеспечивает дополнительную поддержку того, что TP53RTG транслируется и функционирует.

E) Неполное обсуждение влияния увеличения числа копий p53 на биологию организма, подавление опухоли и старение / старение.Литература по p53 изобилует исследованиями, изучающими влияние дополнительных копий гена p53, включая «ретрогены». Рецензенты пришли к выводу, что эта рукопись будет значительно улучшена путем тщательного обсуждения этих исследований. Напр., Авторы должны обсудить псевдогены p53 у мышей и крыс, которые экспрессируются и, по-видимому, нарушают активность функционального p53. Важно отметить, что хорошо установлено, что дополнительная копия полноразмерного p53 у мышей приводит к гиперактивной апоптотической активности, сокращая продолжительность жизни организма, а также вызывая нейродегенеративные заболевания.Таким образом, авторы должны обсудить мышиные модели ‘super p53’ (García-Cao et al., EMBO J 2002; Tyner et al., Nature 2002; Maier et al. Genes and Dev 2004).

Другим важным моментом в этой области является то, что авторы не обсуждали тот факт, что TP53RTG12, по-видимому, является единственным высоко экспрессируемым псевдогеном p53 в клетках слона. Как могли авторы сделать вывод, что низкая заболеваемость раком у слонов обусловлена ​​«множественными копиями» псевдогенов p53, в то время как эффекты всех TP53RTG, по-видимому, управляются одним ретрогеном, TP53RTG12? Фактически, авторы показывают, что все TP53RTGs экспрессируются в данных последовательности РНК – хотя на очень различных уровнях – и им следует подчеркнуть это наблюдение; в противном случае эта история не согласуется с существованием двух экспрессированных псевдогенов p53 у крыс и двух или одного экспрессированного псевдогена p53 у мыши (Tanooka et al., Cancer Res. 1998 и Джин 2001). Авторы сделали очень важное открытие, так как виды слонов, возможно, развили молекулярный механизм, чтобы отделить подавляющую опухоль активность p53 от его активности, способствующей старению. Таким образом, авторы должны уточнить, является ли количество RTG и / или тканеспецифическая экспрессия RTG и / или тип RTG (то есть, как определено аминокислотной последовательностью RTG), которые точно настраивают активность p53 в направлении усиленное подавление опухоли без гиперреактивности к клеточному стрессу.

Мы полностью переписали обсуждение, чтобы подробно рассмотреть потенциальные функциональные последствия генов TP53RTG для биологии организма, подавления опухоли и старения / старения. Например, мы подробно обсуждаем модели трансгенных мышей с дополнительными копиями TP53, включая мышей «super p53», в отношении возможных компромиссов с такими чертами, как преждевременное старение и ускоренное репродуктивное старение. Мы также предполагаем, что слоны могли избежать этих затрат, потому что функциональные гены TP53RTG, вероятно, эволюционировали через нефункциональные промежуточные продукты, которые накапливали мутации потери функции, которые минимизировали избыточность с TP53.

Как мы обсуждали более подробно выше, наши данные в сочетании с данными, опубликованными в Abegglen et al. предполагают, что транскрибируется по крайней мере пять генов TP53RTG, многие из которых, вероятно, тканеспецифичны. Однако мы не имели в виду, что все или даже большинство TP53RTG экспрессируются и функционируют. В самом деле, мы подозреваем, что многие из них являются нефункциональными псевдогенами, порожденными простым процессом рождения и смерти, в котором уровень рождаемости превышает уровень смертности, что приводит к нейтральному накоплению псевдогенов TP53RTG.Можно ожидать, что этот процесс будет «снежным комом», что приведет к быстрому накоплению псевдогенов. Чтобы решить эту проблему, мы добавили раздел в Обсуждение («Смущение богатства?»), В котором прямо говорится, что мы ожидаем, что только часть генов TP53RTG будет функционировать в любой момент эволюции слонов и что ген семья, вероятно, развивается в процессе рождения и смерти.

Что касается потенциально экспрессируемых или функциональных псевдогенов TP53 у мышей и крыс, мы тщательно изучили литературу, включая Tanooka et al.(1998) и Tanooka et al. (2001) и не смогли найти доказательств того, что псевдогены Muroid TP53 экспрессируются. Tanooka et al. (1998), например, сообщают об образовании химеры между TP53 и псевдогеном TP53 у мышей, которое возникает из-за гомологичной рекомбинации после повторного локального β-облучения. Рекомбинация произошла около 5′-конца экзона 5, что привело к делеции 5 пар оснований в экзоне 6 экспрессированного аллеля TP53. В последующем исследовании сообщается о создании трансгенных мышей, несущих мутантную версию этого аллеля TP53 (mp53), но ни одно исследование не предоставляет доказательств того, что псевдоген экспрессируется.Аналогичным образом Tanooka et al. (2001) сообщают об идентификации псевдогена TP53 во многих популяциях и видах мышей, но не предоставляют доказательств того, что эти псевдогены экспрессируются. Мы обнаружили несколько работ, описывающих псевдогены TP53 у мышей и крыс (Ciotta et al., 1995; Czosnek et al., 1984; Hulla, 1992; Tanooka et al., 1995; Weghorst et al., 1995; Zakut-Houri et al. ., 1983), но ни один из них не сообщает данные о выражениях. Таким образом, мы заключаем, что прямых доказательств того, что псевдогены TP53 экспрессируются у мышей и крыс, мало.

https://doi.org/10.7554/eLife.11994.032

Модель репликации, индуцированной микрогомологией, для происхождения вариации числа копий человека

Abstract

Структурные изменения хромосомы с неповторяющимися конечными точками, связанными с геномными нарушениями, открывают окно в механизм происхождения вариации числа копий (CNV). Недавнее сообщение о не повторяющихся дупликациях, связанных с болезнью Пелицея-Мерцбахера, выявило три отличительных характеристики.Во-первых, большинство событий можно рассматривать как сложные, показывая прерывистые дупликации, смешанные с делециями, инвертированными дупликациями и тройными повторами. Во-вторых, соединения в конечных точках показывают микрогомологию из 2–5 пар оснований (п.н.). В-третьих, конечные точки находятся рядом с ранее существовавшими низкокопийными повторами (LCR). Используя эти наблюдения и доказательства репарации ДНК у других организмов, мы выводим модель репликации, опосредованной микрогомологией, индуцированной разрывом (MMBIR) для происхождения CNV и, в конечном итоге, LCR. Мы предполагаем, что разрыв репликационных вилок в стрессированных клетках, дефицитных по гомологичной рекомбинации, вызывает аберрантный процесс репарации с особенностями репликации, индуцированной разрывом (BIR).В этих условиях одноцепочечные 3′-хвосты от сломанных репликационных вилок будут отжигаться с микрогомологией на любой одноцепочечной ДНК поблизости, инициируя низкопроцессивную полимеризацию с множеством переключателей матрицы, генерирующих сложные перестройки, и в конечном итоге восстанавливая процессивную репликацию.

Образец цитирования: Hastings PJ, Ira G, Lupski JR (2009) Модель репликации, вызванной микрогомологией, для происхождения вариации числа копий человека. PLoS Genet 5 (1): e1000327.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000327

Редактор: Иван Матич, Парижский университет Декарта, INSERM U571, Франция

Опубликовано: 30 января 2009 г.

Авторские права: © 2009 Hastings et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения; R01 GM64022 – PJH и R01 GM80600 – GI.

Введение

За последние несколько лет мы узнали, что основным компонентом различий между людьми является вариация в количестве копий сегментов генома и генов, включенных в эти сегменты (вариация количества копий или CNV) ( для определения сокращений см. Таблицу 1). Значительная часть генома вовлечена в CNV [1] – [11] – по оценкам до 12% [4], что может возникать как мейотически, так и соматически, как показывает открытие, что однояйцевые близнецы могут различаться по CNV [12 ].CNV был важным компонентом эволюции приматов [13] – [16]. Здесь мы опираемся на данные о механизме транзакций ДНК у Escherichia coli , дрожжей, Drosophila , млекопитающих и рака человека, чтобы получить модель происхождения CNV, основанную на механизме BIR, возникающем в местах микрогомологии (микрогомология -опосредованная БИР или ММБИР).

Геномные расстройства

Хотя мы можем видеть, что значительные вариации в количестве копий допустимы или выгодны для их носителя, некоторые гены чувствительны к дозировке, и дупликация или делеция с участием этих генов приводит к возникновению клинических фенотипов человека, которые вместе называются геномными расстройствами. [17].Это позволило установить структурные изменения и, таким образом, изучить происхождение CNV. Что касается повторяющихся перестроек, большая часть CNV возникает из-за гомологичной рекомбинации между сегментами, которые уже существуют в виде двух или более копий. Когда это происходит, последовательности, которые находятся между повторениями, которые рекомбинируют, будут либо дублированы, либо удалены, тем самым изменяя количество копий. Этот процесс называется неаллельной гомологичной рекомбинацией или NAHR [18]. Повторяющиеся последовательности, которые рекомбинируют, могут иногда быть сильно повторяющимися последовательностями, которые широко встречаются в геноме человека [19], но обычно представляют собой последовательности, которые встречаются только дважды или несколько раз (т.е.е. низкокопийные повторы, LCR или сегментарные дупликации, SD). LCR имеют тенденцию возникать кластерами в очень сложных областях генома. Эти повторяющиеся сегменты могут быть короткими (около 10 тыс. Пар оснований (т.п.н.)) или длиной до нескольких сотен т.п.н., и они встречаются в любой ориентации. Некоторые примеры областей геномного комплекса показаны на рисунке 1.

Рис. 1. Анализ in silico выявил сложную геномную архитектуру в областях неповторяющейся реаранжировки.

(A) ∼3 Mb вокруг гена PLP1 и (B) ∼4 Mb вокруг гена MECP2 на Х-хромосоме содержат многочисленные LCR в различной ориентации [33], [106].LCR представлены стрелками из цветных блоков, и аналогичные копии LCR обозначаются цветом и буквой для данной последовательности. Ориентация указывается направлением стрелки блока.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000327.g001

Конечные точки CNV, возникшие в результате NAHR, встречаются в нескольких положениях, где имеется достаточная гомология для гомологичной рекомбинации. Хотя многие геномные нарушения возникают из-за NAHR [20], некоторые перестройки имеют конечные точки во многих различных положениях.Эти CNV возникли de novo в результате перегруппировок в сайтах, не имеющих обширной гомологии. Недавние данные о распределении непатологических CNVs у двух индивидуумов предполагают, что большинство различий в количестве копий от эталонной последовательности возникло из-за не повторяющихся событий [2]. Таким образом, непериодические хромосомные изменения возникают довольно часто [21]. Поскольку неповторяющиеся события предположительно отражают происхождение большей части сложности генома, их изучение важно для понимания геномных нарушений, генетической изменчивости из-за CNV и эволюции человека.

Болезнь Пелицея-Мерцбахера (PMD; код доступа 312080 Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/) представляет собой рецессивное Х-сцепленное геномное заболевание, поражающее центральную нервную систему. что возникает из-за разовых хромосомных изменений. Изменения включают дупликацию, тройную репликацию или делецию гена PLP1 . Клинический фенотип позволяет идентифицировать людей, демонстрирующих нерекуррентные хромосомные изменения в области PLP .При исследовании структурных вариаций геномов пациентов с ПМД Lee et al. [22] описывают некоторые аспекты тонкой структуры вновь возникающих CNV с неповторяющимися конечными точками и сообщают о трех поразительных свойствах их структуры, которые помогают нам понять происхождение CNV. Во-первых, авторы сообщают, что новые соединения образуются на сайтах микрогомологии, то есть на участках гомологии длиной от 2 до 5 нуклеотидов, которые слишком короткие, чтобы поддерживать гомологичную рекомбинацию. О таких соединениях сообщалось ранее в случаях неповторяющихся конечных точек делеций и дупликаций [19], [23], [24].Во-вторых, они заметили, что новые структуры являются сложными, демонстрируя дупликацию и делецию, перемежающуюся с недуплицированными или троекратными длинами, и показывая дублированные сегменты в любой ориентации. Об этих характеристиках сообщалось ранее [25] – [31]. В-третьих, хотя эти события не возникают из-за NAHR, новые соединения имеют тенденцию происходить в непосредственной близости от LCRs [32] – [34]. На рисунках 2 и 3 показаны примеры этих сложных разовых событий. Непериодические перегруппировки ранее приписывались механизму негомологичного соединения концов (NHEJ) [19], [20], [24], [33].Однако характеристики микрогомологических соединений и структурная сложность в этих новых структурах, выявленные с помощью нуклеотидного секвенирования и сравнительной геномной гибридизации с высоким разрешением, привели Lee et al. [22], чтобы предположить, что перестройки возникли посредством основанного на репликации механизма, названного FoSTeS (остановка вилки и переключение матрицы), механизм, предложенный ранее для амплификации в E. coli [35]. Модели, основанные на репликации, также были предложены для объяснения происхождения грубых хромосомных перестроек, наблюдаемых у небольшой доли пациентов с муковисцидозом и гемофилией А.Анализ делеций вовлеченных генов выявляет сложные структуры, подобные тем, которые описаны для PLP1 [28], [29], [31].

Рисунок 2. Сложные перестройки с участием PLP1 , обнаруженные с помощью анализа соединений (A) и сравнительного анализа геномной гибридизации олигонуклеотидного массива (B) [22].

(A) Сложная дупликация области PLP1 , обнаруженная с помощью полимеразной цепной реакции, обращенной наружу. Панель (i) показывает область PLP1 с положениями обращенных наружу праймеров.Структура дублированной области показана на (ii) с увеличением области сложного соединения на (iii). Два или три п.н. микрогомологии, обозначенные буквами A, C, G и T, были обнаружены на стыках точек разрыва (открытые стрелки). (B) Делеции и дупликации, обнаруженные у двух пациентов с болезнью Пелицея-Мерцбахера и их матери-носителя [24], продемонстрированы сравнительной геномной гибридизацией. За делецией размером ~ 190 т.п.н. следует сегмент размером ~ 9 т.п.н. без изменения числа копий, и была обнаружена прерванная дупликация размером ~ 190 т.п.н. (i).На панели (ii) показано увеличение массива, показывающее прерывание дупликации ~ 190 т.п.н. В каждом горизонтальном желтом поле выше синие линии представляют собой среднее значение точек данных. Красные точки данных указывают на увеличение количества копий, зеленые точки данных указывают на потери, а черные точки данных указывают на отсутствие изменения количества копий. Оси и демонстрируют относительную гибридизацию; геномная позиция находится на оси x . Панель (iii) суммирует структуру, основанную на сравнительной геномной гибридизации, где зеленый прямоугольник показывает удаленную область, красные прямоугольники показывают дублированные области, а черные линии показывают области без изменений.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000327.g002

Рис. 3. Сложные геномные перестройки на PLP1 , наблюдаемые у пациентов с болезнью Пелицея-Мерцбахера, иллюстрирующие сложность как на большом, так и на коротком расстоянии.

Дубликаты показаны красным, удаления – зеленым, тройные – синим, а количество копий не изменилось – черным. Фигурка выполнена не в масштабе. Ориентировочные положения даны относительно PLP1 .

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1000327.g003

Перестройки генома при раке

Объем структурных вариаций в раковых клетках иногда настолько велик [36], что невозможно определить, какие изменения произошли в одном и том же событии. Однако можно видеть, что дупликации часто бывают прерывистыми, а области соединений включают вставки соседних, несвязанных и неизвестных последовательностей, а также делеции и инверсии [37], показывая, что события реаранжировки в раковых клетках являются сложными.Многие исследования сообщают о микрогомологии на стыках значительной части структурных вариаций (например, [37] – [39]). Исследования конечных точек транслокации при лейкемии и других видах рака показывают, что многие соединения имеют микрогомологию и связаны со вставками и делециями различной длины [40] – [42]. Эти наблюдения совместимы по крайней мере с некоторыми из геномной нестабильности, наблюдаемой при образовании и прогрессировании опухоли, которая проистекает из того же основного механизма, что и образование неповторяющихся дупликаций при геномных нарушениях.

Участие репликации в структурных изменениях хромосомы

В системе анализа Lac в E. coli [43] амплификация оперона lac до 20–100 копий происходит в ответ на стресс голодания [44], [44] [ 45]. Новые соединения амплифицированных сегментов (ампликонов) показывают, что конечные точки встречаются на участках микрогомологии 2–15 п.н. [35], [46]. Некоторые ампликоны сложные, содержащие как прямые, так и инвертированные повторы. Многие другие не могут быть идентифицированы с помощью обращенной наружу полимеразной цепной реакции (наблюдение также часто встречается при анализе дупликационных соединений PLP1 [22]), которая выявила бы соединения простых тандемных повторов, и поэтому предполагается, что они являются сложными, а не простые тандемные повторы [35], [46], [47].По этим критериям около 25% ампликонов являются сложными. Таким образом, в отношении микрогомологии и сложности структурные изменения хромосом в этой системе напоминают изменения, обнаруживаемые при не повторяющихся событиях при геномных нарушениях человека.

Для гомологичной рекомбинации необходим белок RecA (Rad51 у эукариот) (см. Обзор [48]). Опосредованное микрогомологией образование делеции в E. coli (менее 25 нуклеотидов гомологии) давно известно как RecA-независимое [49] – [52]. RecA-независимые короткие гомологически опосредованные делеции (25-50 нуклеотидов) ранее приписывались переключению матрицы в репликационной вилке во время репликации ДНК (rev. [53]).Доказательством этого является, во-первых, то, что мутации в генах, кодирующих функции репликации, влияют на формирование этих событий; во-вторых, мутации, влияющие на восстановление после репликационного несоответствия, влияют на них, помещая событие очень близко к вилке репликации; в-третьих, эта мутация 3′-экзонуклеаз имеет эффект, который согласуется с концами, используемыми для прайминга синтеза ДНК; и в-четвертых, очень трудно получить мутации, влияющие на этот процесс, с помощью мутагенеза транспозонов, предполагающих важные функции.

В системе E. coli Lac, изучение генетических требований вызванной стрессом амплификации выявило некоторые детали механизма. Во-первых, в событиях участвуют 3′-концы ДНК. Это видно по увеличению амплификации, когда ген 3′-экзонуклеазы ( xonA ) удален, и по снижению, когда 3′-экзонуклеаза сверхэкспрессируется. Подобная манипуляция с 5′-экзонуклеазой не дает эффекта [35]. Это предполагает, что амплификация происходит за счет свободных 3′-концов в клетке, большая часть которых обычно удаляется экзонуклеазой.Как указано выше, участие 3′-концов, но не 5′-концов, согласуется с праймингом синтеза ДНК.

Во-вторых, процессинг отстающей цепи в репликационных вилках связан с потребностью в 5′-экзонуклеазном домене ДНК полимеразы I (Pol I) [35], [45]. Pol I участвует в репликации отстающих цепей, эксцизионной репарации оснований и эксцизионной репарации нуклеотидов, но эти процессы эксцизионной репарации не участвуют в амплификации [35], поэтому отстающие нити в репликационных вилках участвуют в амплификации.

В-третьих, существует потребность в репарации белков двухцепочечных разрывов (DSB) посредством гомологичной рекомбинации [35] (система RecBC, обзор в [48]). То, что это действительно необходимо для репарации DSB (а не только белков), показано открытием, что двухцепочечное расщепление ДНК in vivo около lac увеличивает скорость амплификации [54].

Взятые вместе, эти наблюдения предлагают модель для амплификации в системе Lac в E. coli , в которой репликация перезапускается в сайтах репарации двухцепочечных концов ДНК [35].Предлагаемая гипотеза заключалась в том, что переключение шаблонов происходит во время перезапуска репликации при остановленных ответвлениях репликации. Поскольку задействованные расстояния превышают длины, которые, как ожидается, будут выставлены как одноцепочечные на одной вилке репликации, было высказано предположение, что переключение происходит между разными вилками репликации [35].

Идея о том, что структурные изменения хромосом происходят из репликации ДНК, получила поддержку в исследовании опосредованного микрогомологией образования SD у дрожжей [55].Эти авторы поддерживают идею о том, что механизм образования SD включает репликацию, показывая, что его частота повышается при лечении камптотецином и зависит от Pol32, компонента Polδ (обсуждается ниже). Камптотецин – это ингибитор топоизомеразы I, который оставляет в ДНК разрывы. Считается, что эти зазубрины превращаются в свернутые вилки, когда их достигает вилка репликации. Таким образом, увеличение частоты разрушения вилки увеличивает частоту образования дупликации. Эти авторы также сообщают, что ситуации, которые приводят к остановке вилки, а не к коллапсу, мало влияют на частоту образования дупликаций [55].Таким образом, оказывается, что субстрат для дупликации представляет собой одинарный двухцепочечный конец свернутой репликационной вилки.

Эту модель переключения шаблона на большие расстояния также использовали Lee et al. [22] для объяснения наблюдений за неповторяющимися хромосомными изменениями, наблюдаемыми при болезни Пелицея-Мерцбахера, обсужденных выше, и сопоставления множественных геномных последовательностей, обычно разделенных большими геномными расстояниями [22], [56]. Эксперименты по интеграции негомологичной ДНК в клетки млекопитающих выявили микрогомологические соединения и вставку последовательности из других частей генома в эти соединения.Эти наблюдения были интерпретированы в терминах аналогичной модели повторного копирования и переключения на другой шаблон [57].

Репликация, индуцированная разрывом

Более конкретная модель перезапуска репликации при свернутых (сломанных) вилках репликации, BIR [58], была разработана для дрожжей, и был предложен аналогичный механизм для объяснения поддержания теломер в клеточных линиях дрожжей и человека, которые утратили теломеразную активность (см. обзор [59]). Недавние данные [60], [61] позволяют предположить, что механизм BIR можно модифицировать, чтобы объяснить сложность структурных изменений хромосом, описанных выше для человека и E.coli . Рисунок 4 иллюстрирует механизм ЗБИ. Когда репликативная геликаза встречает разрыв на цепи-шаблоне (рис. 4A), одно плечо вилки репликации отламывается (рис. 4B). Нет второго конца, который мог бы участвовать в механизмах репарации DSB, которые доступны в DSB, состоящем из двух двухцепочечных концов: гомологичная рекомбинация или негомологичное соединение концов. 5′-конец сломанной руки иссекается экзонуклеазой, чтобы оставить 3′-выступ (рис. 4С). Этот 3′-хвост вторгается в гомологичную последовательность, обычно сестринскую хроматиду, из которой он произошел.Эта инвазия опосредуется белком RecA / Rad51 (рис. 4D). 3′-конец запускает синтез ДНК и устанавливает репликационную вилку, состоящую из синтеза как ведущей, так и отстающей цепи [61] (рис. 4E). Эта репликация имеет низкую процессивность, и расширенное плечо отделено от сестринской хроматиды (рис. 4E). Такое разделение может быть достигнуто путем миграции соединения Холлидея, показанного на рисунках 4D и 4E. 3 ‘конец повторяется, и процесс повторяется (рис. 4G и 4H). После нескольких циклов инвазии, расширения и разделения вилка репликации становится более процессивной, и репликация продолжается до конца хромосомного плеча или до конца репликона.Переход от низкой процессивности к высокопроизводительной репликации может быть объяснен переключением вовлеченных ДНК-полимераз [61]. Было показано, что начальное удлинение от двухцепочечного конца требует комплекса примазы и Polδ, особенно несущественной субъединицы Pol32, тогда как более процессивный Polε требуется для удлинения 30 т.п.н. до теломеры. На рис. 4I показана завершенная пара хроматид с консервативной сегрегацией нового материала, как это предлагается для E. coli [62]. Это могло бы произойти, если бы соединение Холлидея следовало за вилкой репликации.Другая возможность состоит в том, что соединение Холлидея разрешается так, что будет полуконсервативная сегрегация старых и новых цепей ДНК [60], (обзор в [63]). Доказательства консервативной сегрегации новых цепей ДНК в BIR, предполагающие, что соединение Холлидея не разрешилось, были представлены для E. coli [62].

Рисунок 4. Ремонт свернутой вилки репликации с помощью BIR.

Когда вилка репликации встречает зарубку в нити шаблона (A) (стрелка), одно плечо вилки отламывается (красный), образуя сложенную вилку (B).На одинарном двунитевом конце резектируют 5′-прядь, получая 3′-выступ (C). 3′-одноцепочечный конец вторгается в сестринскую молекулу (синий), образуя D-петлю (D), которая впоследствии становится репликационной вилкой с репликацией как ведущей, так и отстающей цепи (E). На месте D-петли есть развязка Холлидей. Миграция соединения Холлидея или некоторая другая активность геликазы отделяет удлиненный конец с двумя цепями от его матриц (F). Отделенный конец снова обрабатывается для получения 3′-одноцепочечного конца, который снова вторгается в сестру и образует репликационную вилку (G).В конце концов вилка репликации становится полностью процессивной и продолжает репликацию до конца хромосомы (H и I). Этот процесс показан здесь с соединением Холлидея, следующим за вилкой, так что вновь образованные нити разделяются вместе (консервативная сегрегация) (H). Каждая линия представляет собой нуклеотидную цепь (нить) ДНК. Полярность обозначена половинными стрелками на конце 3 ‘. Новый синтез ДНК показан пунктирными линиями. Публикации, на которых основана эта модель, цитируются в тексте.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1000327.g004

Повторное удлинение и разделение были интерпретированы как повторяющиеся попытки найти другую сторону разрыва, состоящего из двух двухцепочечных концов. Когда, в конце концов, ничего не обнаруживается, потому что это свернутая вилка, а не двусторонний DSB, остаток хромосомы заменяется репликацией [60], [63]. Паттерн повторяющихся циклов переключения матрицы с последующей длительной репликацией подтверждается наблюдениями BIR у дрожжей.BIR можно вызвать экспериментально путем трансформации хромосомного фрагмента в дрожжевую клетку [64]. Используя такую ​​систему, Smith et al. [60] поместили хромосомный фрагмент с центромерой и одной теломерообразующей последовательностью в диплоидную дрожжевую клетку. Фрагмент гомологичен обоим гомологам хромосомы III. Эти гомологи были помечены по-разному. Выбор маркера на фрагменте, выбранном для клеток, в которых фрагмент приобрел вторую теломер. Эти авторы обнаружили, что большинство фрагментов завершили репликацию 50 т.п.н. до конца хромосомы, с которой фрагмент имел гомологию.Поразительным результатом было то, что многие из восстановленных хромосом переключились с одного гомолога на другой. В некоторых случаях было замечено более одного переключателя. Переключатели были ограничены первыми 10 т.п.н., после чего был скопирован единственный гомолог. В нескольких процентах случаев переключение происходило на другую хромосому на участках повторяющейся гомологии, состоящих из длинного концевого повтора ретротранспозона. Таким образом, было продемонстрировано, что BIR вызывает сложность видов, описанных выше, для амплификации E. coli и для неповторяющихся конечных точек при геномных нарушениях человека.

BIR был предложен как механизм, лежащий в основе SD и других структурных изменений у дрожжей, например, [55], [65], [66] и человека, например, [31], [67]. Как обсуждается ниже, BIR сильно зависит от RecA / Rad51 и гомологии, и поэтому не может объяснить наблюдения микрогомологии, связанной со сложными перестройками, без существенных изменений.

Microhomology-Mediated BIR (MMBIR)

BIR, как описано выше, обычно является точным процессом, поскольку повторяющиеся инвазии опосредованы RecA / Rad51 и включают большую длину гомологии между последовательностями ДНК.Инвазия, катализируемая RecA / Rad51, требует обширной гомологии около 50 п.н. у E. coli [68] и более у эукариот [69], [70]. Это не соответствует описанным выше соединениям микрогомологий. Поэтому мы предполагаем, что в этих системах вилки репликации восстанавливаются независимым от RecA / Rad51 образом. Rad51-независимый BIR встречается в дрожжах с гораздо более низкой эффективностью, чем Rad51-зависимый BIR [71], [72], хотя его частота очень сильно увеличивается за счет наличия необычных структур, таких как инвертированный повторить [71].Однако рекомбинация теломер в отсутствие теломеразы эффективна в отсутствие Rad51 и обеспечивается очень короткими гомологиями [73], [74] (rev. [59]). Тот факт, что рекомбинация теломер происходит с помощью BIR, подтверждается открытием того, что он требует того же набора ферментов, что и BIR, который инициируется в середине хромосомы [61]. Отсутствие или нехватка RecA / Rad51 может возникнуть из-за стресса клеток, как описано ниже. То, что опосредованное микрогомологией образование SD происходит у дрожжей с помощью механизма BIR, подтверждается открытием, что, подобно опосредованному гомологией BIR [61], оно требует Pol32 [55].

В клетках млекопитающих существует удивительно эффективный путь репарации DSB, опосредованный микрогомологией. Большинство, если не все, экспериментальные исследования репарации DSB, опосредованной микрогомологией, проводились с разрывами, индуцированными нуклеазами. Этот недавно описанный путь был охарактеризован в актах рекомбинации, индуцированных нуклеазами I-SceI или RAG1 / RAG2 в клетках, дефицитных по классическому NHEJ, и в раковых клетках [75], [76]. Нуклеазы генерируют двусторонние разрывы случайным образом по отношению к продолжающимся вилкам репликации.Однако BIR действует в обстоятельствах, когда восстановление DSB, включая NHEJ, не является вариантом, потому что после разрушения вилки репликации остается только один конец без второго конца, с которым один конец может быть отожжен или лигирован. Спонтанное повреждение ДНК происходит преимущественно во время репликации [77] – [79], так что механизмы, которые восстанавливают отдельные концы ДНК, более подходящим образом задействуются для спонтанного повреждения, чем механизмы, которые действуют на двусторонние DSB. Мы предполагаем, что новый путь, опосредованный микрогомологией BIR (MMBIR), используется для восстановления одинарных двухцепочечных концов, когда доступны участки одноцепочечной ДНК и имеют общую микрогомологию с 3′-одноцепочечным концом от свернувшейся вилки.

Можно ожидать, что одноцепочечная ДНК будет возникать в репликационных вилках, из остановившихся транскрипционных комплексов, в трактах эксцизионной репарации или во вторичных структурах ДНК, таких как крестообразные или шпильки, вызванные сложной геномной архитектурой, и, возможно, в других ситуациях, например, в промоторе. регионы и источники репликации. Размеры большинства обсуждаемых здесь переключателей шаблонов (от десятков до сотен килобайт, т. Е. Длина дупликации или делеции) исключают механизмы проскальзывания репликации в пределах одной репликационной вилки.Способность любой области одноцепочечной ДНК, которая имеет микрогомологию с одноцепочечным 3′-концом, принимать участие в событиях, объясняет, почему MMBIR неточен и склонен приводить к структурным изменениям хромосом. Очень короткая гомология не должна быть препятствием для перезапуска репликационной вилки, потому что полимераза eta, используемая в репарации DSB у позвоночных [80], [81], эффективна в инициировании синтеза новой ДНК из несовпадающих праймеров и даже праймеров длиной от 2 до 3. п.н. [82].

Наличие инвертированных повторов может генерировать шпильки, которые открывают одноцепочечную последовательность [22], [32].Кроме того, шпилечные структуры могут увеличивать вероятность остановки репликационной вилки, которая затем может инициировать BIR. Такая важная роль вторичных структур ДНК в генерации структурных изменений хромосом предлагает объяснение кластеризации структурных изменений, производящих сложные хромосомные области, такие как те, что показаны на рисунке 1. Модель MMBIR представлена ​​на рисунке 5.

Рисунок 5. ММБИР.

На рисунке показаны последовательные переключения в разные позиции генома (выделенные цветом), образующие микрогомологические соединения (стрелки).Для наглядности характер одноцепочечных областей отжига не определен (см. Текст). (A) показывает сломанное плечо свернутой вилки репликации, которое образует новую вилку с низкой процессивностью, как показано на (B). Расширенный конец многократно диссоциирует ((C и E) показаны с резецированными 5′-концами) и восстанавливает вилку на разных шаблонах (D и F). На (F) переключатель возвращается к исходной сестринской хроматиде (синий), образуя процессивную вилку репликации, которая завершает репликацию. (G) показывает конечный продукт, содержащий последовательность из разных геномных областей.Каждая линия представляет собой нуклеотидную цепь (нить) ДНК. Полярность обозначена половинными стрелками на конце 3 ‘. Происходит ли возврат к сестринской хроматиде перед или за положением исходного коллапса, определяет, есть ли делеция или дупликация (см. Таблицу 2).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000327.g005

Четкое различие между NHEJ и BIR, опосредованное микрогомологией, состоит в том, что во втором случае микрогомологические соединения сопровождаются более короткими или более длинными участками последовательности ДНК, полученной откуда-нибудь.От 10 до 20% негомологичных соединений в клетках млекопитающих имеют последовательность, встроенную в соединение [83]. Некоторые события, которые ранее интерпретировались как происходящие с помощью механизма NHEJ, могли произойти с помощью MMBIR с одним переключением шаблона. Кроме того, события, которые казались простыми событиями соединения концов, могли иметь сложность, не раскрываемую используемыми методами.

Контроль BIR и MMBIR

Остается главный вопрос – почему клетки используют микрогомологию, а не репарацию, управляемую гомологией? Вероятный ответ – Rad51 недоступен или в дефиците.Это может быть вызвано стрессовой реакцией. Доказательства, подтверждающие это, получены из исследований рака. Гипоксия в микроокружении опухоли коррелирует с генетической нестабильностью [84], [85] (см. Обзор [86]). Было показано, что гипоксия приводит к репрессии RAD51 и BRCA1 [87], [88] и к снижению гомологичной рекомбинации [87], [89] (обзор в [89], [90]). Это было интерпретировано как переключение от гомологичной рекомбинации с высокой точностью к более низкой точности NHEJ, вызванной стрессом [87], [88].В ответвлениях со свернутой репликацией, где NHEJ невозможен, мы предполагаем, что подавление RAD51 не позволяет BIR следовать по Rad51-зависимому от гомологии BIR-пути, но все же позволяет Rad51-независимый BIR-путь, который требует гораздо меньшей гомологии, поскольку наблюдается при рекомбинации теломер у почкующихся дрожжей [73], [74]. Если Rad51 подавляется, но не отсутствует, может преобладать состояние, при котором разрешается некоторая гомологичная инвазия, но этого недостаточно, чтобы предотвратить возникновение некоторых нелегитимных событий, как было засвидетельствовано у Drosophila с уменьшенной дозировкой гена Rad51 [91].Мы не знаем, способствует ли склонность к ошибкам этой репарации подавление репарации ошибочного спаривания, о которой также сообщалось для подвергнутых стрессу раковых клеток [92], [93]. Могут быть и другие изменения в экспрессии генов при стрессе, которые способствуют нестабильности генома (например, [94]).

Похожий переход от репарации DSB с высокой точностью к низкой виден у E. coli в ответ на стресс голодания [54]. Точно так же опосредованная микрогомологией амплификация, наблюдаемая в системе Lac у E.coli , описанная выше, вызвана стрессом, о чем свидетельствует наблюдение, что событие произошло после начала голодания [44], а также открытие, что адаптивная амплификация в этой системе требует голодания и общего стрессового ответа транскрипционного активатора RpoS [95] .

Механизм MMBIR, как описано выше, включает отжиг одноцепочечной ДНК с минимальной гомологией. Следовательно, фермент, ответственный за это, играет центральную роль в предлагаемом механизме.Мы предполагаем, что отжиг катализируется Rad52. Rad52 необходим для реакции одноцепочечного отжига, которая удаляет последовательность между прямыми повторами [96], и отжигает отдельные цепи in vitro [97]. Хромосомные перестройки у дрожжей, которые имеют микрогомологию на стыках, происходят в отсутствие Rad51, но они требуют Rad52 [42], [66], [98]. В одном из этих случаев частые переключения были связаны с микрогомологическими соединениями в Rad51-независимом, Rad52-зависимом процессе, который продуцирует транслокации и инверсии в сайтах сильно дивергированных генов [66].Эти авторы предположили, что эти события произошли путем переключения шаблона во время BIR [66]. In vitro Rad51 ингибирует активность Rad52 по отжигу одиночных цепей [99], указывая тем самым, что отсутствие Rad51 может осуществлять жесткий контроль перехода от инвазии цепей к отжигу одиночных цепей. Однако образование Rad51-независимых SDs, опосредованных микрогомологией, у дрожжей оказалось Rad52-независимым [55]. Rad52 также не требуется для соединения концов, опосредованного микрогомологией [100]. Эти наблюдения показывают, что образование микрогомологических соединений может быть опосредовано разными белками у дрожжей, а также Rad52.

Таким образом, мы предполагаем, что, поскольку стресс вызывает уменьшение количества доступного Rad51, оставляя Rad52 неизменным, количество гомологичного взаимодействия, которое используется для репарации, уменьшается, оставляя отжиг одиночных цепей ДНК в качестве основного доступного механизма. для ремонта разрушенных вилок репликации. Таким образом, классический BIR будет сокращен, а MMBIR заменен.

Разрывы на большие расстояния в дупликациях

Идея о том, что существует физиологическое состояние всей клетки, которое способствует негомологичным взаимодействиям, имеет дальнейшие последствия.Если преобладает условие, допускающее одно такое событие, возможно, что в той же ячейке произойдут и другие негомологичные события. Возможность множественных циклов событий была предложена для дрожжевой системы, чтобы исправить инверсию, которая дала бы дицентрическую хромосому [66]. Мы также отмечаем, что в дупликациях у человека есть разрывы (короткие области, которые не дублируются) и троекратные области внутри дупликаций в масштабе сотен килобайт или мегабайт друг от друга (Рисунки 2 и 3). Эти прерывания на большом расстоянии нелегко объяснить переключением шаблонов на ранних стадиях одного события ЗБИ, когда переключение происходит после того, как один шаблон копируется из сотен пар оснований в несколько тысяч пар оснований (рис. 2 и [60]), но скорее предполагают что более одного события BIR произошло на одной и той же хромосоме.MMBIR требует, в дополнение к общеклеточной реакции на стресс, специфической структуры ДНК: одинарного двухцепочечного конца. Чтобы объяснить, почему одинарные двухцепочечные концы должны располагаться последовательно вдоль одной и той же хромосомы, мы предполагаем, что соединение Холлидея, образованное во время BIR, следует за вилкой репликации, как мы предложили выше как механизм разделения удлиненного сломанного конца. Если репликационная вилка, образованная BIR, по какой-либо причине останавливается, соединение Холлидея может затем пройти через вилку, отделяя вновь синтезированную ДНК от ее матрицы и, таким образом, заново генерируя свернутую вилку (как на рис. 4E и 4F) и приводя к неоднородности на больших расстояниях, наблюдаемые в дублированных сегментах, как показано на рисунке 3.

Структурные последствия MMBIR для хромосомы

Способы, которыми MMBIR может приводить к различным структурным изменениям хромосомы, суммированы в Таблице 2. Транслокации могут образовываться при переключении на другую хромосому. Дублирование происходило, когда переключатель находился либо на сестре, либо на гомологе за положением, в котором вилка сложилась (относительно направления движения вилки). Удаление происходит, когда есть переключатель в положение перед развалом вилки.Переключение на последовательность, которая уже была продублирована, за концом дублированной последовательности, приведет к трипликации. Переключение на ту же молекулу, которая находится за положением коллапса вилки, может инициировать репликацию по методу катящегося круга и, как следствие, амплификацию. Переключение либо на сестринскую молекулу, либо на гомолог в перевернутой ориентации дало бы перевернутый хромосомный сегмент. Если следует репликация на большие расстояния, это может сформировать дицентрическую хромосому, так что за ней должна последовать вторая инверсия, чтобы клетка была жизнеспособной.Эта потребность во втором переключателе привела к идее, что может быть более одного раунда событий переключения, участвующих в формировании некоторых структурных изменений [66], как обсуждалось выше. Альтернативно, второй инвертированный шаблонный переключатель в одной серии переключений может восстановить жизнеспособную хромосомную структуру.

Значение модели

Мы предполагаем, что описанный здесь репликативный механизм способствует геномным нарушениям, которые показывают неповторяющиеся конечные точки, вносит свой вклад в большую часть хромосомной структурной нестабильности, которая возникает соматически при образовании рака и прогрессировании опухоли, а также в происхождение геномной конституциональной структуры. структурная сложность, которая лежит в основе геномных нарушений NAHR и является движущей силой эволюции.Мы предлагаем доказательства существования такого механизма, полученные от различных организмов, и предполагаем, что модель предлагает направления для будущих исследований, которые позволят дополнительно прояснить молекулярные детали.

Механизм MMBIR влияет на биологию человека на многих уровнях. Во-первых, на клеточном уровне механизм может применяться к событиям, лежащим в основе образования и прогрессирования рака. Во-вторых, на уровне организма мы предполагаем, что MMBIR, действующий в зародышевой линии, вызовет CNV и сопутствующие геномные нарушения и хромосомные синдромы.В то же время MMBIR может создавать LCR, которые обеспечивают гомологию, необходимую для NAHR, что приводит к геномным нарушениям в будущих поколениях. В-третьих, на уровне видов, мы предполагаем, что сложные области генома генерируют вторичные структуры, которые увеличивают вероятность MMBIR, так что сложная архитектура становится более сложной в эволюционной временной шкале, как это было задокументировано для эволюции приматов [13], [16]. Мы предполагаем, что MMBIR может лежать в основе геномных перестроек и CNV, связанных с появлением специфических для приматов признаков [10], [13], [101].Более того, MMBIR предоставляет материал, на котором действуют естественный отбор и эволюция: вариация в количестве копий может изменять уровни экспрессии включенных генов, а также обеспечивать избыточные копии генов, которые затем могут быть мутированы и изменены для кодирования новых функций [102] – [104] . Более того, образование негомологичных соединений может перетасовывать экзоны разных генов для достижения новых функций (F. Zhang и J. Lupski, неопубликованные наблюдения). Действительно, эти области сложной геномной архитектуры были названы рассадниками генов, т.е.е., регионы, в которых образуются новые гены [13], [14].

Модель MMBIR предсказывает, что сложные геномные перестройки часто будут сопровождаться значительной потерей гетерозиготности и, в некоторых случаях, потерей импринтинга, потому что копируемая хромосома может быть либо сестрой, либо гомологом. Такая потеря гетерозиготности может привести к региональной однопородной дисомии [105] как потенциальному новому механизму заболевания. Мы также прогнозируем, что описанные здесь события будут видны в модельных системах в условиях, когда клетки подвергаются стрессу, и изучение активности репарации ДНК в стрессированных клетках может стать благодатной почвой для исследований.

Благодарности

Мы благодарны докторам. J.A. Ли, С. Розенберг, Дж. Уилсону за помощь и комментарии.

Список литературы

1. 1. Яфрат А.Дж., Феук Л., Ривера М.Н., Листевник М.Л., Донахью П.К. и др. (2004) Обнаружение крупномасштабных вариаций в геноме человека. Нат Генет 36: 949–951.
2. 2. Корбель Дж.О., Урбан А.Е., Affourtit JP, Годвин Б., Груберт Ф. и др. (2007) Картирование парных концов выявляет обширные структурные вариации в геноме человека.Наука 318: 420–426.
3. 3. Себат Дж., Лакшми Б., Троге Дж., Александр Дж., Янг Дж. И др. (2004) Крупномасштабный полиморфизм числа копий в геноме человека. Наука 305: 525–528.
4. 4. Редон Р., Исикава С., Fitch KR, Феук Л., Перри Г. Х. и др. (2006) Глобальные различия в количестве копий в геноме человека. Природа 444: 444–454.
5. 5. Вонг KK, deLeeuw RJ, Dosanjh NS, Kimm LR, Cheng Z, et al. (2007) Комплексный анализ общих вариаций числа копий в геноме человека.Am J Hum Genet 80: 91–104.
6. 6. Khaja R, Zhang J, MacDonald JR, He Y, Joseph-George AM и др. (2006) Сравнение сборки генома выявляет структурные варианты в геноме человека. Нат Генет 38: 1413–1418.
7. 7. Ньюман Т.Л., Тузун Э., Моррисон В.А., Хайден К.Э., Вентура М. и др. (2005) Полногеномный обзор структурных различий между человеком и шимпанзе. Genome Res 15: 1344–1356.
8. 8. Фиглер Х., Редон Р., Эндрюс Д., Скотт С., Эндрюс Р. и др.(2006) Точное и надежное высокопроизводительное обнаружение вариаций числа копий в геноме человека. Genome Res 16: 1566–1574.
9. 9. Комура Д., Шен Ф., Исикава С., Fitch KR, Чен В. и др. (2006) Общегеномное определение вариаций числа копий человека с использованием массивов олигонуклеотидов высокой плотности ДНК. Genome Res 16: 1575–1584.
10. 10. Лупски JR (2007) Структурные вариации в геноме человека. N Engl J Med 356: 1169–1171.
11. 11. Тузун Э., Шарп А.Дж., Бейли Дж.А., Каул Р., Моррисон В.А. и др.(2005) Мелкомасштабные структурные вариации генома человека. Нат Генет 37: 727–732.
12. 12. Bruder CEG, Poitrowski A, Gijsbers AACJ, Andersson R, Erickson S, et al. (2008) Фенотипически согласованные и дискордантные монозиготные близнецы демонстрируют разные профили вариаций числа копий ДНК. Am J Hum Genet 82: 1–9.
13. 13. Дюма Л., Ким Й., Каримпур-Фард А., Кокс М., Хопкинс Дж. И др. (2007) Вариация числа копий генов, охватывающая 60 миллионов лет эволюции человека и приматов.Genome Res 17: 1266–1277.
14. 14. Нахон Дж. Л. (2003) Рождение «специфичных для человека» генов в ходе эволюции приматов. Genetica 118: 193–208.
15. 15. Бейли Дж. А., Эйхлер Э. Э. (2006) Сегментарные дупликации приматов: тигли эволюции, разнообразия и болезней. Нат Рев Генет 7: 552–564.
16. 16. Stankiewicz P, Shaw CJ, Withers M, Inoue K, Lupski JR (2004) Серийные сегментные дупликации во время эволюции приматов приводят к сложной архитектуре генома человека.Genome Res 14: 2209–2220.
17. 17. Lupski JR (1998) Геномные расстройства: структурные особенности генома могут привести к перестройке ДНК и появлению признаков болезней человека. Тенденции Genet 14: 417–422.
18. 18. Станкевич П., Лупски Дж. Р. (2002) Архитектура генома, перестройки и геномные нарушения. Тенденции Genet 18: 74–82.
19. 19. Shaw CJ, Lupski JR (2005) Неповторяющиеся делеции 17p11.2 генерируются гомологичными и негомологичными механизмами.Hum Genet 116: 1–7.
20. 20. Lupski JR, Stankiewicz P (2005) Геномные расстройства: молекулярные механизмы перестройки и переданные фенотипы. PLoS Genet 1: e49.
21. 21. Lupski JR (2006) Структурные вариации генома и признаки спорадических заболеваний. Нат Генет 38: 974–976.
22. 22. Lee JA, Carvalho CM, Lupski JR (2007) Механизм репликации ДНК для создания неповторяющихся перестроек, связанных с геномными нарушениями. Ячейка 131: 1235–1247.
23. 23. Nobile CT, Rizzi L, Simionati F, Nigro B, Cardazzo V, Patarnello B, Valle T, Danieli G, GA (2002) Анализ 22 точек разрыва делеции в интроне дистрофина 49. Hum Genet 110: 418–421.
24. 24. Иноуэ К., Осака Х., Терстон В.К., Кларк Дж. Т., Йонеяма А. и др. (2002) Геномные перестройки, приводящие к делеции PLP1, происходят из-за негомологичного соединения концов и вызывают разные дисмиелинизирующие фенотипы у мужчин и женщин. Am J Hum Genet 71: 838–853.
25. 25.Ли Дж. А. (2006) Молекулярный анализ единовременных дупликаций генома, вызывающих болезнь Пелизея-Мерцбахера и ее аллельное расстройство параплегии типа 2. [докторская диссертация] Хьюстон (Техас): кафедра молекулярной генетики и генетики человека, Медицинский колледж Бейлора.
26. 26. Потоцкий Л. Б., В., Тредуэлл-Диринг Д., Карвалью С. М., Эйферт А., Фридман Е. М. и др. (2007) Характеристика синдрома Потоцкого-Лупски (dup (17) (p11.2p11.2)) и определение критического интервала, чувствительного к дозировке, который может указывать на фенотип аутизма.Am J Hum Genet 80: 633–649.
27. 27. Vissers LE, Stankiewicz P, Yatsenko SA, Crawford E, Creswick H, et al. (2007) Сложные перестройки хромосомы 17p, связанные с малокопийными повторами у двух пациентов с врожденными аномалиями. Hum Genet 121: 697–709.
28. 28. Chen JM, Chuzhanova N, Stenson PD, Férec C, Cooper DN (2005) Внутрихромосомное последовательное проскальзывание репликации в транс приводит к различным геномным перестройкам, включающим инверсии. Хум Мутат 26: 362–373.
29. 29. Ферек С., Казальс Т., Чужанова Н., Мацек М.Дж., Бьенвену Т. и др. (2006) Грубые геномные перестройки, включающие делеции в гене CFTR: характеристика шести новых событий из большой когорты до сих пор не идентифицированных хромосом муковисцидоза и метаанализ лежащих в основе механизмов. Eur J Hum Genet 14: 562–567.
30. 30. дель Гаудио Д., Фанг П., Скаглиа Ф., Уорд П.А., Крейген В.Дж. и др. (2006) Увеличение числа копий гена MECP2 в результате геномной дупликации у мужчин с задержкой нервного развития.Genet Med 8: 784–792.
31. 31. Шин Ч.Р., Джуэлл У.Р., Моррис С.М., Бреннан С.О., Ферек С. и др. (2007) Двойные комплексные мутации с участием F8 и FUNDC2, вызванные репликацией, индуцированной отдельным разрывом. Хум Мутат 28: 1198–2006.
32. 32. Станкевич П., Шоу С.Дж., Даппер Д.Д., Вакуи К., Шаффер Л.Г. и др. (2003) Архитектура генома катализирует непериодические хромосомные перестройки. Am J Hum Genet 72: 1101–1116.
33. 33. Ли Дж. А., Иноуэ К., Чунг С. В., Шоу К. А., Станкевич П. и др.(2006) Роль геномной архитектуры в дупликации PLP1, вызывающей болезнь Пелицея-Мерцбахера. Hum Mol Genet 15: 2250–2265.
34. 34. Ли Дж. А., Мадрид Р. Е., Сперле К., Риттерсон К. М., Хобсон Г. М. и др. (2006) Спастическая параплегия типа 2, связанная с аксональной невропатией и очевидным эффектом положения PLP1. Энн Нейрол 59: 398–403.
35. 35. Slack A, Thornton PC, Magner DB, Rosenberg SM, Hastings PJ (2006) О механизме амплификации гена, индуцированной под стрессом в Escherichia coli .PLoS Genet 2: e48.
36. 36. Волик С., Рафаэль Б.Дж., Хуанг Дж., Страттон М.Р., Бигнель Дж. И др. (2006) Расшифровка мелкомасштабной структуры генома и транскриптома рака груди. Genome Res 16: 394–404.
37. 37. Бигнелл Г.Р., Сантариус Т., Поул Дж. К., Батлер А. П., Перри Дж. И др. (2007) Архитектура соматической перестройки генома в ампликонах рака человека при разрешении на уровне последовательностей. Genome Res 17: 1296–1303.
38. 38. Canning S, Dryja TP (1989) Короткие прямые повторы в точках разрыва делеций гена ретинобластомы.Proc Natl Acad Sci U S A 86: 5044–5048.
39. 39. Коно Т., Йоката Дж. (2006) Молекулярные процессы делеций хромосомы 9p21, вызывающие инактивацию гена-супрессора опухоли p16 при раке человека: вывод из структурного анализа точек останова для делеций. Ремонт ДНК (Amst) 5: 1273–1281.
40. 40. Чжан И, Зелезник-Ле Н, Эммануэль Н, Джаятилака Н, Чен Дж и др. (2004) Характеристика геномных точек разрыва в MLL и CBP у больных лейкемией с t (11; 16).Гены Хромосомы Рак 41: 257–265.
41. 41. Чжан Ю., Стриссел П., Стрик Р., Чен Дж., Нуцифора Г. и др. (2004) Точки разрыва геномной ДНК в кластере AML1 / RUNX1 и ETO с расщеплением ДНК топоизомеразой II и сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I при лейкозе t (8; 21). Proc Natl Acad Sci U S A 99: 3070–3075.
42. 42. Chen C, Umezu K, Kolodner RD (1998) Хромосомные перестройки происходят в мутантах S. cerevisiae rfa1 из-за мутагенных повреждений, обрабатываемых репарацией двухцепочечного разрыва.Mol Cell 2: 9–22.
43. 43. Кэрнс Дж., Фостер П.Л. (1991) Адаптивная реверсия мутации сдвига рамки считывания в Escherichia coli . Генетика 128: 695–701.
44. 44. Hastings PJ, Bull HJ, Klump JR, ​​Rosenberg SM (2000) Адаптивная амплификация: механизм индуцибельной хромосомной нестабильности. Ячейка 103: 723–731.
45. 45. Hastings PJ, Slack A, Petrosino JF, Rosenberg SM (2004) Адаптивная амплификация и точечная мутация являются независимыми механизмами: данные о различных механизмах индуцируемых стрессом мутаций.PLoS Biol 2: e399.
46. 46. Kugelberg E, Kofoid E, Reams AB, Andersson DI, Roth JR (2006) Множественные пути амплификации выбранных генов во время адаптивной мутации. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 17319–17324.
47. 47. Гастингс П.Дж. (2007) Адаптивное усиление. Критический обзор Biochem Mol Biol 42: 1–13.
48. 48. Friedberg EC, Walker GC, Siede W., Wood RD, Schultz RA, et al. (2005) Ремонт ДНК и мутагенез. Вашингтон (округ Колумбия): ASM Press.
49. 49. Ikeda H, Shimizu H, Ukita T, Kumagai M (1995) Новый анализ незаконной рекомбинации в Escherichia coli : стимуляция образования лямбда-биотрансдуцирующего фага ультрафиолетовым светом и его независимость от функции RecA. Adv Biophys 31: 197–208.
50. 50. Альбертини AM, Hofer M, Calos MP, Miller JH (1982) О формировании спонтанных делеций: важность гомологии коротких последовательностей в генерации больших делеций.Ячейка 29: 319–328.
51. 51. Farabaugh PJ, Schmeissner U, Hofer M, Miller JH (1978) Генетические исследования lac-репрессора. VII. О молекулярной природе спонтанных горячих точек в гене lacI Escherichia coli. J Mol Biol 126: 847–857.
52. 52. Симидзу Х., Ямагути Х., Ашизава Й., Коно Й., Асами М. и др. (1997) Независящая от короткой гомологии незаконная рекомбинация у Escherichia coli : механизм, отличный от незаконной рекомбинации, зависимой от короткой гомологии.J Mol Biol 266: 297–305.
53. 53. Бзимек М., Ловетт С.Т. (2001) Нестабильность повторяющихся последовательностей ДНК: роль репликации во многих механизмах. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 8319–8325.
54. 54. Ponder RG, Fonville NC, Rosenberg SM (2005) В основе стресс-индуцированной мутации лежит переход от высокоточной к подверженной ошибкам репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Mol Cell 19: 791–804.
55. 55. Payen C, Koszul R, Dujon B, Fischer G (2008) Сегментарные дупликации возникают в результате Pol32-зависимой репарации сломанных вилок с помощью двух альтернативных механизмов, основанных на репликации.PLoS Genet 4: e1000175.
56. 56. Бранзей Д., Фойани М. (2007) Переключение шаблона: от ремонта репликационной вилки к перестройке генома. Ячейка 131: 1228–1230.
57. 57. Merrihew RV, Marburger K, Pennington SL, Roth DB, Wilson JH (1996) Высокочастотная незаконная интеграция трансфицированной ДНК в предварительно интегрированные целевые сайты в геном млекопитающего. Mol Cell Biol 16: 10–18.
58. 58. Morrow DM, Connelly C, Hieter P (1997) Дупликация «Break-copy»: модель образования хромосомного фрагмента в Saccharomyces cerevisiae .Генетика 147: 371–382.
59. 59. McEachern MJ, Haber JE (2006) Репликация, индуцированная разрывом и рекомбинационное удлинение теломер в дрожжах. Анну Рев Биохим 75: 111–135.
60. 60. Smith CE, Llorente B, Symington LS (2007) Переключение матрицы во время репликации, вызванной разрывом. Природа 447: 102–105.
61. 61. Lydeard JR, Jain S, Yamaguchi M, Haber JE (2007) Репликация, индуцированная разрывом, и независимое от теломеразы поддержание теломер требуют Pol32.Природа 448: 820–823.
62. 62. Мотамеди М., Сигети С.К., Розенберг С.М. (1999) Восстановление двухцепочечных разрывов в Escherichia coli : физические доказательства механизма репликации ДНК in vivo . Genes Dev 13: 2889–2903.
63. 63. Льоренте Б., Смит С.Е., Симингтон Л.С. (2008) Репликация, индуцированная разрывом: что это такое и для чего? Клеточный цикл 7: 859–864.
64. 64. Heiter P, Mann C, Snyder M, Davis RW (1985) Митотическая стабильность дрожжевых хромосом: анализ цвета колонии, который измеряет нерасхождение и потерю хромосом.Cell 40: 381–392.
65. 65. Дим А., Баркер К., Ванхулле К., Даунинг Б., Вайл А. и др. (2008) Дефектная репликация, индуцированная разрывом, приводит к половинным кроссоверам у Saccharomyces cerevisiae. Генетика 179: 1845–1860.
66. 66. Schmidt KH, Wu J, Kolodner RD (2006) Контроль транслокаций между сильно дивергированными генами с помощью Sgs1, гомолога Saccharomyces cerevisiae белка синдрома Блума. Mol Cell Biol 26: 5406–5420.
67. 67. Bauters M, Van Esch H, Friez MJ, Boespflug-Tanguy O, Zenker M и др.(2008) Непериодические дупликации MECP2, опосредованные разрывами ДНК, управляемыми геномной архитектурой, и репарацией репликации, индуцированной разрывом. Genome Res 18: 847–858.
68. 68. Lovett ST, Hurley RL, Sutera VA Jr, Aubuchon RH, Lebedeva MA (2002) Кроссинг между областями ограниченной гомологии в Escherichia coli . RecA-зависимые и RecA-независимые пути. Генетика 160: 851–859.
69. 69. Liskay RM, Letsou A, Stachelek JL (1987) Требование гомологии для эффективного преобразования генов между дублированными хромосомными последовательностями в клетках млекопитающих.Генетика 115: 161–167.
70. 70. Reiter LT, Hastings PJ, Nelis E, De Jonghe P, Van Broeckhoven C и др. (1998) Продукты мейотической рекомбинации человека, выявленные путем секвенирования горячей точки для обмена гомологичной цепью у пациентов с множественной делецией HNPP. Am J Hum Genet 62: 1023–1033.
71. 71. ВанХулле К., Лемуан Ф.Дж., Нараянан В., Даунинг Б., Халл К. и др. (2007) Инвертированная ДНК повторяет репарацию каналов отдаленных двухцепочечных разрывов в слияниях хроматид и хромосомных перестройках.Mol Cell Biol 27: 2601–2614.
72. 72. Davis AP, Symington LS (2004) RAD51-зависимая репликация, индуцированная разрывом в дрожжах. Mol Cell Biol 24: 2344–2351.
73. 73. Le S, Moore JK, Haber JE, Greider CW (1999) RAD50 и RAD51 определяют два пути, которые взаимодействуют для поддержания теломер в отсутствие теломеразы. Генетика 152: 143–152.
74. 74. Teng SC, Zakian VA (1999) Рекомбинация теломер-теломер является эффективным путем обхода для поддержания теломер в Saccharomyces cerevisiae .Mol Cell Biol 19: 8083–8093.
75. 75. Bentley J, Diggle CP, Harnden P, Knowles MA, Kiltie AE (2004) Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК при раке мочевого пузыря человека подвержено ошибкам и связано с соединением концов, связанным с микрогомологией. Nucleic Acids Res 32: 5249-5259.
76. 76. Corneo B, Wendland RL, Deriano L, Cui X, Klein IA, et al. (2007) Мутации тряпки показывают надежное альтернативное соединение концов. Природа 449: 483–486.
77. 77. Lisby M, Barlow JH, Burgess RC, Rothstein R (2004) Хореография реакции на повреждение ДНК: пространственно-временные отношения между контрольными точками и белками репарации.Ячейка 118: 699–713.
78. 78. Пеннингтон Дж. М., Розенберг С. М. (2007) Спонтанный разрыв ДНК в отдельных живых клетках Escherichia coli . Nat Gen 39: 797–802.
79. 79. Салех-Гохари Н., Брайант Х. Э., Шульц Н., Паркер К. М., Кассель Т. Н. и др. (2005) Спонтанная гомологичная рекомбинация индуцируется развилками коллапса репликации, которые вызваны эндогенными разрывами однонитевой ДНК. Mol Cell Biol 25: 7158-7169.
80. 80. Макилрайт М.Дж., Вайсман А., Лю Ю., Фаннинг Э., Вудгейт Р. и др.(2005) ДНК-полимераза человека эта способствует синтезу ДНК из промежуточных звеньев инвазии цепи гомологичной рекомбинации. Mol Cell 20: 783–792.
81. 81. Кавамото Т., Араки К., Сонода Э., Ямасита Ю.М., Харада К. и др. (2005) Двойная роль ДНК-полимеразы eta в гомологичной рекомбинации ДНК и транслезионном синтезе ДНК. Mol Cell 20: 793–799.
82. 82. Каннистраро В.Дж., Тейлор Дж.С. (2007) Способность полимеразы эта и ДНК-полимеразы Т7 обходить структуры выпуклости.J Biol Chem 282: 11188–11196.
83. 83. Roth DB, Chang XB, Wilson JH (1989) Сравнение ДНК-наполнителя при иммунных, неиммунных и онкогенных перестройках предполагает множественные механизмы образования. Mol Cell Biol 9: 3049–3057.
84. 84. Янг С.Д., Маршалл Р.С., Хилл Р.П. (1988). Гипоксия вызывает чрезмерную репликацию ДНК и увеличивает метастатический потенциал опухолевых клеток мышей. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 9533–9537.
85. 85. Coquelle A, Toledo F, Stern S, Bieth A, Debatisse M (1998) Новая роль гипоксии в прогрессировании опухоли: индукция хрупкого сайта, запускающего геномные перестройки и образование сложных DM и HSR.Mol Cell 2: 259–265.
86. 86. Субарский П., Хилл Р.П. (2003) Микроокружение гипоксической опухоли и метастатическое прогрессирование. Clin Exp Metastasis 20: 237–250.
87. 87. Биндра RSS, Чаффер П.Дж., Мэн А., Ву Дж., Мосейд К. и др. (2004) Подавление Rad51 и снижение гомологичной рекомбинации в гипоксических раковых клетках. Mol Cell Biol 24: 8504–8518.
88. 88. Bindra RS, Glazer PM (2007) Репрессия экспрессии гена RAD51 комплексами E2F4 / p130 при гипоксии.Онкоген 26: 2048–2057.
89. 89. Huang LE, Bindra RS, Glazer PM, Harris AL (2007) Генетическая нестабильность, вызванная гипоксией – рассчитанный механизм, лежащий в основе прогрессирования опухоли. J Mol Med 85: 139–148.
90. 90. Bindra RS, Crosby ME, Glazer PM (2007) Регулирование репарации ДНК в гипоксических раковых клетках. Раковые метастазы Rev 26: 249–260.
91. 91. McVey M, Adams M, Staeva-Vieira E, Sekelsky JJ (2004) Доказательства множественных циклов инвазии цепей во время репарации двухцепочечных разрывов у Drosophila.Генетика 167: 699–705.
92. 92. Bindra RS, Glazer PM (2007) Ко-репрессия экспрессии гена репарации ошибочного спаривания посредством гипоксии в раковых клетках: роль сети Myc / Max. Cancer Lett 252: 93–103.
93. 93. Михайлова В.Т., Биндра Р.С., Юань Дж., Кампизи Д., Нараянан Л. и др. (2003) Снижение экспрессии гена репарации ошибочного спаривания ДНК Mlh2 при гипоксическом стрессе в клетках млекопитающих. Mol Cell Biol 23: 3265–3273.
94. 94. Myung K, Chen C, Kolodner RD (2001) Множественные пути взаимодействуют в подавлении нестабильности генома у Saccharomyces cerevisiae.Nature 411: 1073–1076.
95. 95. Lombardo M-J, Aponyi I, Rosenberg SM (2004) Общий регулятор ответа на стресс RpoS в адаптивной мутации и амплификации в Escherichia coli . Генетика 166: 669–680.
96. 96. Fishman-Lobell J, Haber JE (1992) Удаление негомологичных концов ДНК при рекомбинации с двухцепочечным разрывом: роль дрожжевого гена репарации ультрафиолетового излучения RAD1. Наука 258: 480–484.
97. 97. Mortensen UH, Bendixen HC, Sunjevaric I, Rothstein R (1996) отжиг цепи ДНК стимулируется дрожжевым белком Rad52.Proc Natl Acad Sci U S A 93: 10729–10734.
98. 98. Tsukamoto Y, Kato J, Ikeda H (1996) Эффекты мутаций RAD50, RAD51, RAD52 и родственных генов на незаконную рекомбинацию в Saccharomyces cerevisiae. Генетика 142: 383–391.
99. 99. Wu Y, Kantake N, Sugiyama T, Kowalczykowski SC (2008) Белок Rad51 контролирует Rad52-опосредованный отжиг ДНК. J Biol Chem 283: 14883–14892.
100. 100. Lee K, Lee SE (2007) Saccharomyces cerevisiae Sae2- и Tel1-зависимое образование однонитевой ДНК при разрыве ДНК способствует опосредованному микрогомологией соединению концов.Генетика 176: 2003–2014.
101. 101. Лупски JR (2007) Революция эволюции дает дальнейшее откровение. Биологические исследования 29: 1182–1184.
102. 102. Оно S (1970) Эволюция путем дупликации генов. Берлин, Нью-Йорк: Springer-Verlag.
103. 103. Hurles M (2004) Дупликация генов: геномная торговля запасными частями. PLoS Biol 2: e206.
104. 104. Хиттингер CT, Кэрролл С.Б. (2007) Дублирование генов и адаптивная эволюция классического генетического переключателя.Природа 449: 677–681.
105. 105. Spence JE, Perciaccante RG, Greig GM, Willard HF, Ledbetter DH и др. (1988) Однородительская дисомия как механизм генетического заболевания человека. Am J Hum Genet 42: 217–226.
106. 106. Lee JA, Lupski JR (2006) Геномные перестройки и изменения числа копий генов как причина расстройств нервной системы. Нейрон 52: 103–121.

Вариант номера копии

CNV = Номер копии Варианты = Копировать изменение номера http: // www.illkids.ca/mediaroom/custom/genomevariation06.asp Ген номер копии (также «варианты количества копий» или CNV) – это количество копии определенного гена в генотипе человека. Недавний данные показывают, что количество копий гена может быть увеличено при раке. клетки. Геном человека состоит из 6 миллиардов химических оснований (или нуклеотидов) упакованной ДНК на два набора из 23 хромосом по одному набору наследуется от каждого родителя.ДНК кодирует примерно 27000 генов. Обычно считалось что гены почти всегда присутствовали в двух копиях в геноме. Однако недавние открытия выявили, что большие сегменты ДНК размером от тысяч до миллионы оснований ДНК, могут варьироваться в номер копии. Такие вариации числа копий (или CNV) могут включать гены. ведущий к дисбаланс дозировки. Например, гены, которые считались всегда встречающимися в двух экземплярах на геном сейчас обнаружены иногда присутствовать в одном, трех или более трех экземплярах.В несколько редких случаев гены вообще отсутствуют (см. рисунок). Почему CNV важны? Различия в Последовательность ДНК наших геномов способствует нашей уникальности. Эти изменения влиять больше всего черты характера, включая восприимчивость к болезням. Считалось, что сингл нуклеотидные изменения (так называемые SNP) в ДНК были наиболее распространенная и важная форма генетической изменчивости. Текущие исследования показывают, что CNV составляют в по крайней мере, в три раза больше общего содержания нуклеотидов в SNP.Поскольку CNV часто включают гены, они могут иметь важную роль как в заболевании человека, так и в ответной реакции на лекарства. Понимание механизмы образования CNV также может помочь нам лучше понять геном человека эволюция. Как помогает новая карта CNV? Новый глобальный CNV Карта трансформирует медицинские исследования в четырех областях. Первый и самый Важное направление – поиск генов, лежащих в основе общих заболеваний. К На сегодняшний день попытки идентифицировать эти гены на самом деле не учитывали роль CNVs могут играть в здоровье человека.Во-вторых, используется карта CNV. изучить семейные генетические условия. В-третьих, их тысяч серьезных дефекты развития, вызванные хромосомными перестройками. Карта CNV используется для исключения вариаций, обнаруженных у здоровых людей, помощь исследователям в нацеливании на регион, который может быть задействован. В полученные данные также будут способствовать более точному и полному Эталонная последовательность генома человека, используемая всеми учеными-биомедиками. Часто задаваемые вопросы о CNV г. Вариация номера копий (CNV), проект Генетический болезни вызванные множеством различных возможных изменений (мутаций) в Последовательности ДНК.Мы исследуем прибыли и убытки больших объемов Последовательность ДНК, состоящая из десяти тысяч и пяти миллионов буквы (известные как Вариация числа копий). Этот тип мутации имеет в предыдущих исследованиях часто упускали из виду мутации, вызывающие генетические заболевания. Мы не знаем, какова доля генетических заболеваний. вызвано вариацией количества копий (CNV), но мы подозреваем, что это заметный. Мы уже знаем, что многие генетические заболевания, возникающие в семьи возникают в результате таких мутаций, мы также знаем, что являются вариантами номера копии, которые защищают от ВИЧ-инфекции и малярия.Вклад CNV в общие сложные заболевания (например, диабет, болезни сердца) в настоящее время неизвестны. Сколько существует вариаций количества копий (CNV) между геномами человека? Как лучше всего включить CNV в единое целое исследования ассоциации генома? Каков вклад номер копии вариация на генетическое заболевание? Каков относительный вклад разных мутационные механизмы CNV? Каково геномное влияние CNV на ген выражение? Какую роль играет изменение количества копий в недавняя эволюция человека? ДЕСИФЕР База данных хромосомного дисбаланса и фенотипа у людей, использующих Ensembl Ресурсы г. База данных DECIPHER субмикроскопических хромосомных дисбаланс собирает клиническую информацию о хромосомных микроделеции / дупликации / вставки, транслокации и инверсии и отображает эту информацию на карте генома человека с целями: Повышение медицинских и научных знаний о хромосомных микроделециях / дупликациях Улучшение медицинского обслуживания и генетических рекомендаций для лица / семьи с субмикроскопическим хромосомным дисбалансом Содействие исследованиям в изучении генов которые влияют на человеческое развитие и здоровье Новое документы: Поиск вариантов копий. Никол Раск Природные методы 2008 5 (11) 917 Крупномасштабный копировать числовые варианты (CNV): Распределение у нормальных субъектов и FISH / анализ КПЦР в реальном времени. Инь Цяо, Сюйдун Лю, Шансонетта Гарвард, Сара Л. Нолин, В. Тед Браун, Марьям Кочек, Жанетт Дж. А. Холден, ME Сюзанна Льюис и Эвика Райджан-Сепарович BMC Genomics 2007, 8: 167-177 Глобальные вариации в число копий в геноме человека. Ричард Редон, Шумпей Исикава, Карен Р.Fitch, Ларс Феук, Джордж Х. Перри, Т. Дэниел Эндрюс, Хайке Фиглер, Майкл Х. Шаперо, Эндрю Р. Карсон, Венвэй Чен4, Ын Кён Чо, Стефани Даллэр, Дженнифер Л. Фриман, Хуан Р. Гонсалес, Моника Гратакос, Цзин Хуанг, Димитриос Калайцопулос, Дайсуке Комура, Джеффри Р. Макдональд, Кристиан Р. Маршалл, Руи Мей, Линдал Монтгомери, Кунихиро Нисимура, Коджи Окамура, Фан Шен, Мартин Дж. Сомервилль, Джоэл Чинда, Арман Вальсезия, Кара Вудворк, Фэнтанг Ян, Цзюньцзюнь Чжан, Татьяна Зерджал, Джейн Чжан, Луис Арменгол, Дональд Ф.Конрад, Ксавье Эстивилл, Крис Тайлер-Смит, Найджел П. Картер, Хироюки Абуратани, Чарльз Ли, Кейт У. Джонс, Стивен Шерер и Мэтью Э. Хёрлз Природа (2006) Vol 444. 444-454 Точный и объективное профилирование количества копий в режиме реального времени количественный ПЦР Барбара Д’Ан, Джо Вандесомпеле, Янв. Hellemans Методы Том 50, Выпуск 4, Страниц 262-270 Принятие КПЦР на более высокий уровень: анализ CNV показывает силу высокая пропускная способность кПЦР для улучшения количественного разрешения Suzanne Weaver, Simant Dube, Alain Mir, Jian Цинь, Ганг Сан, Рамеш Рамакришнан, Роберт С.Джонс, Кеннет Дж. Ливак Методы Том 50, выпуск 4, Страницы 271-276 Варианты количества копий и эволюция у людей и шимпанзе. Перри Г. Х., Ян Ф., Маркес-Бонет Т., Мерфи К., Фицджеральд Т., Ли А. С., Хайланд К., Стоун А.С., Хёрлз М.Э., Тайлер-Смит К., Эйхлер Е.Е., Картер Н.П., Lee C, Redon R. Genome Res. 2008 18 (11): 1698-1710 Методы обнаружения и анализа копий вариации на уровне генома и локуса. J.H. Ли и Дж.T. Jeon Cytogenet Genome Res 123: 333–342 (2008) Методы и стратегии анализа копий изменение числа с использованием микрочипов ДНК. Картер Н.П. Нат Генет. 2007 39 (7 приложение): S16-21. Рассмотрение. Одновременная мутация и количество копий обнаружение вариаций (CNV) с помощью мультиплексного секвенирования GS-FLX на основе ПЦР. Goossens D, Moens LN, Nelis E, Lenaerts AS, Glassee W, Kalbe A, Frey B, Kopal G, De Jonghe P, De Rijk P, Del-Favero J. Hum Mutat. 2009 30 (3): 472-476 Полногеномный анализ изоформы транскрипта изменчивость у людей. Кван Т., Беновой Д., Диас С., Гурд С., Провенчер С., Больё П., Хадсон Т.Дж., Sladek R, Majewski J. Nat Genet. 2008 40 (2): 225-231. Оценка количества копий стенограммы с использованием полногеномный олигонуклеотидный микромассив мыши. Марк Дж. Картер, Алексей А. Шаров, Винсент ВанБурен, Давуд Б. Дудекула, Конди Э. Кармак, Чарли Нельсон и Минору С. Х. Ко Genome Biology 2005, 6: R61 Исследование вариаций числа копий в масштабе всего генома идентифицировали ген восприимчивости, UGT2B17, к остеопорозу. Ян Т.Л., Чен XD, Го И, Лэй С.Ф., Ван Дж.Т., Чжоу Ц., Пан Ф, Чен И, Чжан ZX, Dong SS, Xu XH, Yan H, Liu X, Qiu C, Zhu XZ, Chen T, Li M, Zhang H, Zhang L, Drees BM, Hamilton JJ, Papasian CJ, Recker RR, Song XP, Ченг Дж., Дэн Х.В. Am J Hum Genet. 2008 83 (6): 663-674 Сравнительное исследование трех копий на основе ПЦР количество вариантов подходов, CFMSA, M-PCR и MLPA, при делеции 22q11.2 синдром. Ян Ц., Чжу X, Йи Л., Ши З, Ван Х, Ху И, Ван Ю. Генет-тест Mol Biomarkers. 2009 13 (6): 803-808 Вариантное генотипирование GSTT1 по количеству копий и делеции гена GSTM1 с помощью ПЦР в реальном времени. Роуз-Зерилли MJ, Бартон SJ, Хендерсон AJ, Shaheen SO, Holloway JW. Clin Chem. 2009 55 (9): 1680-1685 Высокопроизводительное генотипирование числа копий изменение S-трансфераз глутатиона M1 и T1 с использованием ПЦР в реальном времени у 20 687 человек. Норсков М.С., Фрикке-Шмидт Р., Лофт С., Тибьярг-Хансен А. Clin Biochem. 2009 42 (3): 201-209 Анализ числа копий гена-кандидата с помощью ПЦР и поликапиллярный электрофорез. Szantai E, Elek Z, Guttman A, Sasvari-Szekely M. Электрофорез. 2009 30 (7): 1098-1101. Статистические инструменты для определения количества копий трансгена оценка на основе ПЦР в реальном времени. Джошуа С. Юань, Джейсон Беррис, Натан Р. Стюарт, Аялью Ментеваб и К. Нил Стюарт BMC Bioinformatics 2007, 8 (): S6 Вариация числа копий становится клинической. Отчет о встрече Le Caignec C, Redon R. Genome Biol. 2009; 10 (1): 301-303 Недавние Статьи: Узоры из Естественная изменчивость генов человека. Дана К. Кроуфорд, Дайна Т. Эйки и Дебора А. Никерсон Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. (2005) 6: 287–312 Варианты конструкции: изменение хромосомного ландшафта и дизайна исследований болезней. Ларс Феук, Кристиан Р. Маршалл, Ричард Ф. Уинтл и Стивен У. Шерер Человек Молекулярная генетика (2006) Vol. 15, обзор выпуск 1 R57 – R66 Номер копии вариация: новые взгляды на разнообразие генома. Дженнифер Л. Фриман, Джордж Х. Перри, Ларс Фик, Ричард Редон, Стивен А. МакКэрролл, Дэвид М. Альтшулер, Хироюки Абуратани, Кейт У. Джонс, Крис Тайлер-Смит, Мэтью Э. Хёрлз, Найджел П. Картер, Стивен В. Шерер и Чарльз Ли Геном Исследования (2006) 16: 949–961 В реальном времени Количественная ПЦР как Альтернатива саузерн-блоттингу или флуоресцентной гибридизации in situ для Обнаружение изменений числа копий гена. Jasmien Hoebeeck, Frank Speleman, and Jo Vandesompele Methods in Molecular Biology, vol. 353: 205-226 Протоколы анализа нуклеиновых кислот с помощью нерадиоактивных зондов, второй Издание Отредактировано: Э. Иларио и Дж. Маккей Надежный количественная оценка количества копий гена SMN с помощью TaqMan PCR в реальном времени. Ильза Гомес-Кюре и Карин Г. Робинсон и Вики Л. Фунанедж И Томас О. Кроуфорд, Мена Скавина и Венлан Ван Нейрогенетика (2007) 8: 271–278 Точный метод для количественное определение и анализ вариации количества копий в KIT свиней с помощью анализ лигирования олигонуклеотидов. Бо-Ён Со, Ын-У Пак, Сон-Джин Ан, Санг-Хо, Джэ-Хван Ким, Хён-Тэ Им, Чун-Хон Ли, Ин-Чол Чо, Иль-Гын Конг и Джин-Тэ Чжон BMC Genetics (2007) 8:81 Крупномасштабная копия Числовой полиморфизм в геноме человека. Джонатан Себат, Б. Лакшми, Дженнифер Троге, Джоан Александер, Джанет Янг, Пар Лундин, Сюзанна Манер, Хиллари Масса, Меган Уолкер, Maoyen Чи, Николас Навин, Роберт Лусито, Джон Хили, Джеймс Хикс, Кенни Йе, Эндрю Райнер, Т.Конрад Гиллиам, Барбара Траск, Ник Паттерсон, Андерс Зеттерберг, Майкл Виглер НАУКА (2004) ТОМ 305525-528 Основные изменения в нашей ДНК приводят к серьезным изменениям в нашем мышлении. Джонатан Себат ПРИРОДА ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДОБАВКА (2007) ОБЪЕМ 39 S3-S5 Точно и надежно высокопроизводительное обнаружение вариаций числа копий в геноме человека. Хайке Фиглер, Ричард Редон, Дэн Эндрюс, Кэрол Скотт, Роберт Эндрюс, Кэрол Кардер, Ричард Кларк, Оливер Дови, Питер Эллис, Ларс Фик, Лиза Французский, Пол Хант, 1 Димитриос Калаитцопулос, Джеймс Ларкин, Линдал Монтгомери, Джордж ЧАС.Перри, Боб В. Пламб, Кейт Портер, Рэйчел Э. Ригби, Дайан Риглер, Арманд Вальсезия, Корделия Лэнгфорд, Шон Дж. Хамфрей, Стивен В. Шерер, Чарльз Ли, Мэтью Э. Хёрлз и Найджел П. Картер Геном Research (2006) 16: 1566–1574 Актуальность BAC число копий трансгена у мышей: вариация числа копий трансгена по множественные трансгенные линии и корреляции с трансген целостность и экспрессия. Келли Дж.Чендлер Рональд Л. Чендлер Ева М. Брокельманн Юэ Хоу Э. Мишель Саутард-Смит Дуглас П. Мортлок Мамм Геном (2007) 18: 693–708 Обнаружение крупномасштабные вариации в геноме человека. A Джон Яфрате, Ларс Феук, Мигель Н. Ривера, Марк Л. Листевник, Патриция К. Донахью, Ин Ци, Стивен Шерер и Чарльз Ли ПРИРОДА ГЕНЕТИКА (2004) ТОМ 36 НОМЕР 9 949-951 Мультиплекс На основе ПЦР Анализ захватчиков в реальном времени (mPCR-RETINA): новый метод на основе SNP для Обнаружение аллельной асимметрии в областях вариации числа копий. Наоя Хосоно, Мичиаки Кубо, Юмико Цучия, Хироко Сато, Такуя Китамото, Сусуму Сайто, Ёдзо Охниши и Юсуке Накамура ЧЕЛОВЕК МУТАЦИЯ (2007) 0,1-8 Сильная ассоциация между числом копий митохондриальной ДНК и липогенезом у белых людей жировая ткань. М. Кааман, Л. М. Спаркс, В. ван Хармелен, С. Р. Смит и Э. Шёлин, И. Дальман и П. Арнер Диабетология (2007) 50: 2526–2533 Сборка генома сравнение идентифицирует структурные варианты в геноме человека. Рази Хаджа, Джунджун Чжан, Джеффри Р. Макдональд, Юншу Хе, Энн М. Джозеф-Джордж, Джон Вей, Мухаммад Рафик, Ченг Цянь, Мэри Шаго, Лорена Пантано, Хироюки Абуратани, Кит Джонс, Ричард Редон, Мэттью Хёрлз, Луис Арменгол, Ксавье Эстивилл, Ричард Дж. Mural, Charles Lee, Stephen W Scherer И Ларс Феук ПРИРОДА ГЕНЕТИКА (2006) ОБЪЕМ 38 НОМЕР 12 1413-1418 Эстроген рецептор Число копий альфа-мРНК в иммуногистохимически ERα-положительных, и отрицательный рак груди тканей. Индира Пула и Цинци Юэ BMC Рак 2007, 7: 56-66 Геном в целом измерение изменения числа копий ДНК в нейробластоме: рассечение ампликоны и потери при отображении, приростов и контрольных точек. E. Michels, J. Vandesompele, J. Hoebeeck, B. Menten, K. De Preter, G. Laureys, N. Van Roy, F. Speleman Cytogenet Genome Res (2006) 115: 273–282 Стохастическая мРНК Синтез в клетках млекопитающих. Арджун Радж, Чарльз С. Пескин, Даниэль Транчина, Диана Ю. Варгас, Санджай Тьяги PLOS (2006) Том 4 Выпуск 10 e309 Чувствительные и Специфические анализы полимеразной цепной реакции в реальном времени для точной Определите вариации числа копий (CNV) человеческого комплемента C4A, C4B, Модули C4-Long, C4-Short, и RCCX: Выявление C4 CNV у 50 кровных родственников Субъекты с определенными генотипами HLA 1. Йи Лин Ву, Стефани Л.Савелли, Ян Ян, Би Чжоу, Брэд Х. Ровин, Даниэль Дж. Бирмингем, Хайкади Н. Нагараджа, Ли А. Хеберт и К. Юнг Ю Журнал иммунологии (2007) 179: 3012–3025 Развитие ресурсы по биоинформатике для отображение и анализ количества копий и других вариантов конструкции в геном человека. Дж. Чжан, Л. Феук, Г.Э. Дугган, Р. Хаджа, С.В. Scherer Cytogenet Genome Res (2006) 115: 205–214 Абсолютное и относительное количественное определение количества копий плазмиды с помощью QPCR в Escherichia coli. Чансу Ли, Джаи Ким, Сын Гу Шин, Сеокван Хван Журнал биотехнологии (2006) 123: 273–280

PG1395-PJ6397-CO35217-App Note-NumberVariationUsingDigitalPCR-Americas.indd

% PDF-1.3 % 1 0 объект >] / Pages 3 0 R / Type / Catalog / ViewerPreferences >>> эндобдж 2 0 obj > поток 2014-10-22T17: 09: 41-07: 002014-10-22T17: 09: 45-07: 002014-10-22T17: 09: 45-07: 00 Adobe InDesign CC 2014 (Macintosh) uuid: 94434682-f2f4-8d4c -89d7-dcf4460ab5d4xmp.сделал: 01801174072068118A6D8872D9EC57D0xmp.id: 50bdba24-8b01-4072-9494-5ab67a7bd222proof: pdf1xmp.iid: 7d947d8f-4c69-46c0-a102-4f3b13f4feb1xmp.did: fe5966b6-6e62-4660-ab7d-e7ffe8ef5a3fxmp.did: 01801174072068118A6D8872D9EC57D0default

convertedfrom применение / х -indesign в приложение / pdfAdobe InDesign CC 2014 (Macintosh) / 2014-10-22T17: 09: 42-07: 00

application / pdf

PG1395-PJ6397-CO35217-App Note-NumberVariationUsingDigitalPCR-Americas.indd

Библиотека Adobe PDF 11.0FalsePDF / X-3: 2002PDF / X-3: 2002PDF / X-3: 2002 конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 6 0 obj > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Shading> / XObject >>> / TrimBox [0.0 0.0 612.0 792.0] / Type / Page >> эндобдж 7 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Shading> / XObject >>> / TrimBox [0.0 0.0 612.0 792.0] / Type / Page >> эндобдж 8 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / Shading >>> / TrimBox [0.0 0,0 612,0 792,0] / Тип / Страница >> эндобдж 9 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / TrimBox [0.