Прописи цифра один: Прописи с цифрой 1 — Kid-mama

Распределение CNV в различных диапазонах размеров по геному. Синие столбцы представляют области генома, в которых CNV был найден.Числа на слева указывают диапазон размера CNV. Числа справа показывают количество CNV в этом диапазоне размеров. Моделирование показало значительное обогащение CNV в гетерохроматических областях. (0 из 10 000 имитаций имели такое же количество CNV в гетерохроматине).

Чтобы оценить точность метода обнаружения CNV, мы провели моделирование, в котором значения охвата, полученные на каждом Окно размером 300 п.н. перемешивали случайным образом.Это моделирование показало, что низкая частота CNV является результатом случайной случайности (ложное коэффициент обнаружения 0,003 на уровне выборки; 0,013 на уровне популяции) и хорошие показатели восстановления для CNV, охватывающих минимум 10 окон (≥85% на уровне выборки; ≥83% после фильтрации на уровне популяции) с более низкой скоростью восстановления для CNV охватывающий всего пять окон (31,4% на индивидуальном уровне; 42,2% после фильтрации на уровне популяции).

Чтобы определить геномные факторы, связанные с присутствием CNV, мы исследовали, как CNV распределены относительно тип хроматина и содержание генов. Мы обнаружили, что CNV были особенно распространены в гетерохроматических областях. Из 1557 CNV, 534 (34,3%) были обнаружены в гетерохроматине, который покрывает только 9,3% генома ( P <0,0002; из 10 000 симуляций количество гетерохроматических CNV варьировалось от 44 до 112, в среднем 77).CNV в гетерохроматина также были значительно больше, чем у эухроматина (медиана для гетерохроматина: 7200 п.н., медиана для эухроматина: 3300 п.н .; Тест Вилкоксона, n ₁ = 534, n ₂ = 1023, W = 377190, P <0,0001) (дополнительный рисунок S1).

CNV также были более многочисленны в ген-содержащих регионах. Из 1557 CNV 250 содержали по крайней мере один ген, что значительно больше, чем ожидалось случайно ( P <0.0002; через 10 000 симуляций количество CNV, содержащих гены, варьировалось от 107 до 187, в среднем 145). Поскольку эухроматин обычно содержит больше генов, чем гетерохроматин, мы повторили моделирование, сосредоточив внимание на эухроматине. CNVs и рандомизация их положения в эухроматине. Из 1023 эухроматических CNV 226 содержали по крайней мере один ген, снова представляет собой значительное обогащение генных областей ( P <0.0002; через 10 000 симуляций количество CNV, содержащих гены, варьировалось от 59 до 127, в среднем 92). Этот обогащение было постоянным для всех размеров эухроматических CNV (дополнительная таблица S1).

CNV обогащены семействами генов метаболической устойчивости

Затем мы исследовали, были ли CNV обогащены генами, потенциально участвующими в метаболической устойчивости к инсектицидам.В целом, из из 10939 генов, включенных в анализ, 267 (2,4%) находились в пределах по крайней мере одного CNV (дополнительные данные S2). Из этих 267 генов 28 были кандидатами в гены метаболической устойчивости (определяемые как цитохром P450, глутатион-S-трансфераза или карбоксилэстераза, и далее называемые «генами метаболической детоксикации»). Поскольку многие родственные гены встречаются в кластерах, и поэтому не включены в события CNV независимо друг от друга, мы подсчитали количество CNV, которые включали, по крайней мере, один метаболический детокс-ген.Из 250 CNV, содержащих какие-либо гены, 27 содержали по крайней мере один ген метаболической детоксикации, что значительно больше, чем ожидается случайно ( P <0,0002; из 10 000 симуляций количество генов CNV, содержащих гены детоксикации, варьировалось от 0 до 14, с среднее значение 4). Тот же результат был получен, когда учитывались только эухроматические CNV для всех размеров CNV (дополнительная таблица S2). Хотя между популяциями наблюдались некоторые различия в количестве генов метаболической детоксикации, обнаруженных в CNV (таблица 1), это не было значимым (точный критерий Фишера: P = 0.08).

Количество обнаруженных CNV, содержащих или не содержащих хотя бы один цитохром P450, глутатион-S-трансферазу или карбоксилэстеразу (детокс-гены)

Гены, обнаруженные в CNV, были обогащены 13 терминами онтологии генов молекулярной функции (GO) после многократной корректировки до порогового значения Q , равного 0.05 (Supplemental Data S3), в первую очередь отражая обогащение двух классов генов: цитохрома P450s (важные термины GO включали монооксигеназу активность, связывание гема, связывание ионов железа, активность оксидоредуктазы) и протеазы (важные термины ГО включали несколько форм активности пептидазы). Этот результат также сохраняется, когда гетерохроматические CNV были исключены, с оставшимися 12 из 13 членов GO. значительный (дополнительные данные S3).Никакие GO-термины из онтологий биологических процессов или клеточных компартментов существенно не обогатились.

28 генов метаболической детоксикации, обнаруженных внутри CNV, были преимущественно из кластеров генов, которые ранее были вовлечены при устойчивости к инсектицидам (дополнительные данные S2), причем 16 из 28 генов являются членами эпсилон-кластера глутатион-S-трансферазы ( Gste на хромосоме 3R) или одного из четырех кластеров цитохрома P450 ( Cyp6p на хромосоме 2R, Cyp6m на хромосоме 3R, Cyp6z на хромосоме 3R и Cyp9k1 на хромосоме X).Это еще раз указывает на то, что гены, участвующие в метаболической устойчивости к инсектицидам, были в центре внимания амплификации. События. Поэтому мы выполнили подробный анализ CNV вокруг этих пяти кластеров генов (рис. 2A). Поскольку гены Cyp6aa1 / Cyp6aa2 , которые соседствуют с кластером Cyp6p , также были широко представлены в списке амплифицированных генов (дополнительные данные S2), мы расширили область исследования до Cyp6p3 , включив эти гены.

Чтобы более точно определить количество CNV в каждом из этих пяти кластеров генов, мы использовали несогласованные пары чтения и чтения. выравнивание по контрольным точкам CNV, чтобы различать разные CNV. Три из пяти кластеров генов показали большое количество различных CNVs. Мы идентифицировали 16 аллелей CNV в Cyp9k1 (названных Cyp9k1_Dup1–16) (дополнительные данные S7; дополнительный рис. S4), 15 в кластере Cyp6aa1 – Cyp6p2 (Cyp6aap_Dup1–15) (рис.2B; Дополнительные данные S4; Дополнительный рис. S1), 11 в кластере Gstu4 – Gste3 (Gstue_Dup1–11) (рис. 2C; дополнительные данные S5; дополнительный рис. S2), один на Cyp6m2 (Cyp6m_Dup1) (дополнительные данные S6) (дополнительные данные S6). Дополнительный рис. S3) и один в Cyp6z3 – Cyp6z1 (Cyp6z_Dup1) (дополнительные данные S6; дополнительный рис. S3).

( A ) CNV в кластерах генов, которые, как известно, связаны с метаболической устойчивостью к инсектицидам, были обнаружены на всех трех хромосомах.( B ) Из 15 CNV в Cyp6aa1 – Cyp6p2 , 13 включают Cyp6aa1 и пять включают Cyp6p3 . На вставке карты показаны страны, в которых не менее 5% людей имели CNV в Cyp6aa1 (синий) и Cyp6p3 (красный), а страны, отсутствующие в наборе данных, показаны серым. ( C ) Из 11 дубликатов в Gstu4 – Gste3 , 10 включают Gste2 . На врезке карты показаны страны, в которых не менее 5% людей носили CNV в Gste2 (красный). Черные прямоугольники и вертикальные серые полосы показывают положение генов в кластере, при этом Cyp6aa1 , Cyp6p3 и Gste2 выделены цветом. Фиолетовые горизонтальные полосы показывают степень каждого CNV, а пробел в Gstue_Dup5 показывает удаление в рамках этого расширения. Имена CNV сокращены до Dup # и относятся к Cyp6aap_Dup # и Gstue_Dup # на панелях B и C соответственно.Более подробная информация о каждом из этих CNV, а также о тех из других кластеров генов, представлена ​​в дополнительных данных S5 – S8.

Несколько аллелей CNV были обнаружены в разных популяциях (например, Cyp6aap_Dup7 был обнаружен у An. Coluzzii из Буркина-Фасо, Кот-д’Ивуара, Ганы и Гвинеи) (дополнительные данные S4), хотя ни один из них не был обнаружен во всех популяциях любого вида (дополнительные данные S8).Более того, несколько аллелей CNV, охватывающих одни и те же гены, могут быть обнаружены в одной и той же популяции (например, Cyp9k1_Dup4, Dup11 и Dup15 в An. gambiae из Буркина-Фасо) (Дополнительные данные S7). Для кластера Cyp6aa / p CNV в основном были обнаружены в An. coluzzii из Буркина-Фасо, Кот-д’Ивуара и Ганы (таблица 2). В Cyp9k1 CNV в основном были обнаружены в An. gambiae из Буркина-Фасо, Ганы и Гвинеи.Некоторые гены амплифицировались с очень высокой частотой в определенных популяциях (таблица 2). Например,> 92% от An. gambiae из Буркина-Фасо имел CNV в Cyp9k1 , а> 90% из An. coluzzii из Кот-д’Ивуара содержала гены, покрывающие CNV, в кластере Cyp6aa / p . В целом, 511 из 1142 образцов в этом исследовании (45%) несли хотя бы один из CNV, описанных в этих пяти генах. кластеры.

Число (и доля) лиц с CNV, охватывающими Cyp6aa1 , Cyp6p3 , Gste2 , Cyp6m2 , Cyp6z1 или Cyp9k1

Мы использовали шаблоны несогласованных чтений, поддерживающих каждый из CNV, чтобы предположительно определить тип события дублирования. что их вызвало (рис.3). Из 44 CNV 33 поддерживаются парным считыванием, отображаемым в геноме, обращенными друг от друга и охватывающими область. увеличенного покрытия, что указывает на тандемное дублирование (Дополнительные данные S4 – S7), и два CNV поддерживались отображением пар чтения в одной ориентации, что указывает на тандемную инверсию (Дополнительные данные S4, S7). Остальные CNV были поддержаны чтениями, чьи спаренные или мягко обрезанные основания отображены в другом месте генома, часто в нескольких геномные местоположения, предполагающие роль мобильных элементов (TE) в событии дупликации (Supplemental Data S4 – S7).Два из этих CNV имели фланкирующие последовательности, которые соответствовали известным мобильным элементам в An. gambiae . Базы чтения с мягким вырезом, отображаемые на точки останова Gstue_Dup7 и Gstue_Dup8, соответственно, вернули значительный BLAST попадает в транспозон ДНК hAT (HATN1_AG; E -value = 2 × 10 ⁻²⁶ ) и транспозон, несущий сходство с элементами Mariner / Tc1-подобными (IKIRARA1; E -value = 10 ⁻³⁴ ). ) (Leung and Romans 1998), в базе данных Repbase (Bao et al.2015).

Три типа несогласованных пар чтения ( A – C ) и чтения точки останова ( D ) были использованы для идентификации различных аллелей CNV. ( A ) При тандемном дублировании пары чтения, полученные из сегментов, охватывающих точку останова CNV (красные стрелки), выравниваются лицом от друг друга вокруг точки останова на эталонном геноме (синие стрелки).( B ) В тандемных инверсиях пары считывания, полученные из сегментов, охватывающих конец перевернутого сегмента (красные стрелки), выравниваются по направлению в одном направлении друг с другом вокруг точки останова на эталонном геноме (голубые стрелки). ( C ) При удалении пары чтения, полученные из сегментов, охватывающих удаленную последовательность (красные стрелки), выравниваются в правильной ориентации. вокруг точки останова, но дальше, чем ожидалось, учитывая размер вставки библиотеки секвенирования (зеленые стрелки).( D ) В любом из вышеупомянутых типов CNV (тандемное дублирование показано здесь в качестве примера) считывает пересечение точки останова (красный стрелка) только частично выровняется по обе стороны от точки останова. Для показанного здесь тандемного дублирования начало чтение (светло-коричневая начало стрелки) совпадает с концом дублированной области, тогда как конец считывания (темно-коричневый конец стрелки) выравнивается в начале дублирования.

CNV были дифференцированы на основе их паттернов несогласованных пар чтения, на которые влияет положение Контрольные точки CNV и ориентация дупликации (рис. 3). Возможно, что независимые события дублирования с очень похожими точками останова могут оказаться одним и тем же CNV (например, Cyp6aap_Dup1 может фактически представлять два разных CNV) (Supplemental Data S4), что делает реальное количество событий CNV даже больше, чем сообщается.Точно так же мутация, которая нарушает точку останова CNV может повлиять на его паттерн несогласованных считываний и привести к одному событию CNV, проявляющемуся как два разных аллеля CNV. Хотя мы не можем исключить эту возможность, анализ фона гаплотипов различных CNV показал, что это не случай, по крайней мере, для большинства аллелей CNV (дополнительные данные S8).

CNV в генах метаболической устойчивости проходят положительный отбор

Несколько аллелей CNV были обнаружены с высокими локальными частотами (Supplemental Data S9), что позволяет предположить, что они, вероятно, находятся в процессе положительного отбора.Чтобы исследовать эту возможность, мы поэтапно разделили генотип CNV. обращается к каркасу гаплотипа фазы 2 Ag1000G и вычисляет расширенную гомозиготность гаплотипа (EHH) для аллелей CNV присутствует как минимум у 5% людей в популяции.

Скорость распада EHH вокруг аллелей CNV была постоянно ниже, чем для гаплотипов дикого типа (WT) (рис. 4; дополнительные рис. S6, S8, S10), что подтверждает наше утверждение о том, что эти аллели достигают высокой частоты благодаря положительному отбору.Кроме того, медиана длина общих гаплотипов была значительно выше между парами гаплотипов, несущими один и тот же аллель CNV, чем между гаплотипы дикого типа из той же популяции (бутстрепные 95% доверительные интервалы для медианы не перекрываются) (рис. 5; дополнительные рис. S7, S9, S11).

Доказательства длительного неравновесия по сцеплению вокруг CNV в кластере генов Cyp6aa1 – Cyp6p2 .Распад расширенной гомозиготности гаплотипов (EHH) был рассчитан для гаплотипов CNV и не-CNV (WT) с использованием SNP. извне региона, содержащего CNV (разрыв по оси x ): (BF) Буркина-Фасо; (CI) Кот-д’Ивуар; (UG) Уганда; (col) An. coluzzii ; (гам) Ан. gambiae .

Длина попарно общих гаплотипов больше между образцами, имеющими аллель CNV, чем между образцами дикого типа. Общий Длины гаплотипов рассчитывали по обе стороны от CNV-содержащей области кластера генов Cyp6aa / p . Образцы, не относящиеся к CNV (WT), были взяты из тех же популяций, что и фокальные аллели CNV. Полоски показывают распределение общих длин гаплотипов между всеми парами гаплотипов с одним и тем же основным гаплотипом.Пределы столбцов показывают межквартильный размах, листовки показывают 5-й и 95-й процентили, горизонтальные черные линии показывают медиану, а выемки на столбцах показывают бутстрапированные 95% доверительный интервал для медианы. Имена CNV (Cyp6aap_Dup #) сокращаются как Dup #: (BF) Буркина-Фасо; (CI) Берег Слоновой Кости; (UG) Уганда; (col) An. coluzzii ; (гам) Ан. gambiae .

Фазирование вызовов генотипа CNV было возможно только для простых дупликаций, когда можно было определить зиготность аллелей CNV от оценки количества копий.Для аллелей CNV с более высоким числом копий (тройное и выше) это было невозможно; таким образом, распад EHH не мог быть рассчитан. В случае Cyp9k1 CNV с самой высокой частотой (Cyp9k1_Dup11, обнаруженный в An. Gambiae из Буркина-Фасо, Ганы и Гвинеи) не может быть фазирован. Поэтому мы исследовали, связана ли эта CNV, на уровень выборки с выбранными гаплотипами. Иерархическая кластеризация гаплотипов в этих трех популяциях выявила два больших кросс-популяционных кластера гаплотипов около Cyp9k1 , что указывает на выборочные развертки (дополнительный рис.S12). Кластер 1 был очень сильно связан с Cyp9k1_Dup11 как у мужчин (точный критерий Фишера, P <0,0001) (дополнительная таблица S3), так и у женщин (ранговая корреляция Спирмена: ρ = 0,9, P <0,0001) (рис. 6A). Кластер 2 был связан с присутствием Cyp9k1_Dup15, но корреляция была не такой сильной, как между кластером 1. и Cyp9k1_Dup11 (ранговая корреляция Спирмена: ρ = 0,65, P <0,0001) (рис. 6B; дополнительная таблица S4).

Два основных кластера гаплотипов около Cyp9k1 в Буркина-Фасо, Гане и Гвинее связаны с соответствующими аллелями CNV. Точки дрожат, чтобы показать перекрывающиеся данные. Линии показывают регрессию данных методом наименьших квадратов. ( A ) Сильная корреляция между Cyp9k1_Dup11 и кластером гаплотипов 1.Большинство точек лежат на линии наклона 0,5, что указывает на что Cyp9k1_Dup11 чаще всего встречается как трипликация (две дополнительные копии на хромосому), хотя и более низкие, и более высокие существуют версии этого CNV с номерами копий. ( B ) Более слабая корреляция между Cyp9k1_Dup15 и гаплотипом Cluster 2.

Дупликация

Десять из 11 аллелей CNV, обнаруженных в кластере Gstu4 – Gste3 , включали Gste2 (рис.2), что, возможно, отражает известную важность этого гена в устойчивости к инсектицидам. Хорошо охарактеризованная мутация I114T в Gste2 , как известно, придает устойчивость к ДДТ (Mitchell et al. 2014) и может быть связан с дупликациями генов аналогично другим мутациям, таким как Ace1 G119S. Поэтому мы исследовали, были ли какие-либо аллели CNV в Gste2 связаны с этой мутацией. Gste2 -114T присутствует по всей Африке, а также в An.gambiae и An. coluzzii ( Anopheles gambiae 1000 Genomes Consortium 2017), но в наших данных был связан только с Gstue_Dup1. Gstue_Dup1 был обнаружен в 16 An. coluzzii образцов из Буркина-Фасо, все из которых были по крайней мере гетерозиготными по 114T (дополнительная таблица S5). Наличие гомозигот 114T вместе с соотношением прочтений, поддерживающих аллели I114 и 114T у гетерозигот (примерно 1: 2), указывают, что обе копии Gste2 в Gstue_Dup1 CNV несут мутацию 114T.

Из 15 аллелей CNV, обнаруженных в кластере Cyp6aa1 – Cyp6p2 , пять включали Cyp6p3 , но 13 включали Cyp6aa1 (рис. 2B). Cyp6p3 CNV были обнаружены с высокой (> 50%) частотой в одной популяции (Кот-д’Ивуар An. Coluzzii : 90%), тогда как Cyp6aa1 CNV были обнаружены с высокой частотой в An.coluzzii из Буркина-Фасо (91%), Кот-д’Ивуара (89%) и Гвинеи (75%), а в An. gambiae из Уганды (64%).

Обсуждение

Наше исследование выявило 1557 CNV в 16 популяциях An. gambiae и An. coluzzii , причем CNVs более многочисленны и крупнее в гетерохроматине, чем в эухроматине. Эти параллели приводят к людям и крысам, в котором было обнаружено, что CNV особенно многочисленны в центромерах и теломерах (Nguyen et al.2006; Гурьев и др. 2008), обычно состоящий из гетерохроматина. Распределение CNV по размерам было сильно смещено вправо, при этом небольшие CNV были наиболее распространены как в эухроматине, так и в гетерохроматине, хотя мы не искали CNV размером менее 1500 п.н., чтобы избежать ложных открытия. CNV были смещены в сторону ген-содержащих областей как в целом, так и после исключения гетерохроматиновых областей. Этот смещение для генных областей аналогично было обнаружено при дупликациях у людей (Nguyen et al.2006) и крыс (Гурьев и др., 2008), но не Drosophila (Шрайдер и др., 2016). Таким образом, наши результаты показывают, что изобилие CNV вокруг генов не ограничивается млекопитающими.

Гены, обнаруженные в CNV, сами были обогащены для семей, вовлеченных в метаболическую устойчивость к инсектицидам. Эти результаты зеркальные находки у Drosophila , где цитохром P450 были непропорционально представлены в CNV (Schrider et al.2016). Аналогично в Ae. aegypti , цитохром P450 были обогащены среди генов, демонстрирующих доказательство более высокого числа копий в популяциях, устойчивых к дельтаметрину. по сравнению с восприимчивыми популяциями (Faucon et al. 2015). В нашем исследовании пять метаболических генов, наиболее тесно связанных с устойчивостью к инсектицидам в литературе для An. gambiae и An. coluzzii , которые, как было показано, метаболизируют инсектициды in vitro ( Gste2 , Cyp6p3 , Cyp6m2 , Cyp6z1 и Cyp9k1 ), все они были амплифицированы по крайней мере в одной популяции.Более того, три из этих генов продемонстрировали признаки повторяющегося События CNV внутри и между популяциями, всего 44 различных CNV в пяти кластерах и до 16 в Cyp9k1 . Из 44 CNV большинство (33) были тандемными дупликациями, две – тандемными инверсиями, а две (обе в кластере Gstu4 – Gste3 ) показали связь с известными транспозонами ДНК. Остальные семь не могли быть классифицированы, но наличие неотображаемых последовательностей вокруг точек останова предполагает, что они также могут быть связаны с повторяющимися элементами.

Доказательства важности Gste2 для устойчивости к инсектицидам получены в исследованиях, показывающих его повышение в отношении устойчивости к ДДТ An. gambiae (Динг и др., 2003; Дэвид и др., 2005) и An. funestus (Riveron et al. 2014a) по сравнению с восприимчивыми комарами и трансгенной экспрессией An. gambiae / An. funestus Gste2 в Drosophila , обеспечивающий устойчивость к ДДТ (Mitchell et al.2014; Riveron et al. 2014а). Несинонимичные SNP в Gste2 также были связаны с устойчивостью к ДДТ у An. funestus (Riveron et al. 2014a) и как ДДТ, так и дельтаметрин в An. gambiae (Mitchell et al., 2014; Opondo et al., 2016). В нашем исследовании Gste2 был усилен в Кении, в An. coluzzii из Анголы, Буркина-Фасо и Ганы, а в An. gambiae из Габона и Уганды.

Cyp6p3 активируется у комаров, устойчивых к пиретроидам, ДДТ и бендиокарбу (Djouaka et al.2008; Мюллер и др. 2008; Fossog Tene et al. 2013; Kwiatkowska et al. 2013; Edi et al. 2014; Ngufor et al. 2015), метаболизирует перметрин и дельтаметрин (Müller et al. 2008) и обеспечивает устойчивость к пиретроидам при экспрессии в Drosophila (Edi et al. 2014). Cyp6m2 также активируется у комаров с устойчивостью к перметрину, ДДТ и бендиокарбу (Müller et al. 2007; Djouaka et al. 2008; Mitchell et al. 2012; Edi et al. 2014), метаболизирует пиретроиды и ДДТ ( Стивенсон и др.2011; Mitchell et al. 2012) и обеспечивает устойчивость к пиретроидам, ДДТ и бендиокарбу при экспрессии в Drosophila (Edi et al. 2014). В нашем исследовании было обнаружено, что Cyp6p3 и Cyp6m2 были усилены преимущественно в An. coluzzii из Кот-д’Ивуара, популяция с известной повышающей регуляцией как Cyp6p3 , так и Cyp6m2 по сравнению с восприимчивыми популяциями (Edi et al. 2014). В частности, в случае Cyp6m2 , это повышающее регулирование не может быть вызвано исключительно CNV, потому что частота CNV и количество копий недостаточны для объяснения уровни экспрессии, но давление отбора, направленное на активацию этих генов, могло сыграть роль в поддержании этих CNV в населении.

Cyp6z1 был усилен в An gambiae из Буркина-Фасо и Гвинеи. Cyp6z1 активируется у комаров с устойчивостью к пиретроидам и ДДТ (Nikou et al. 2003; David et al. 2005) и метаболизирует ДДТ и карбарил (Chiu et al. 2008). Наконец, Cyp9k1 был наиболее широко амплифицированным геном из пяти изученных нами кластеров, причем CNV были обнаружены более чем в половине популяций. в нашем наборе данных. Cyp9k1 активируется у комаров, устойчивых к пиретроидам и ДДТ (Fossog Tene et al. 2013; Thomsen et al. 2014; Ngufor et al. 2015), и метаболизирует дельтаметрин (Vontas et al. 2018). Более того, селективное прочесывание в области Cyp9k1 было связано с устойчивостью к инсектицидам у An. coluzzii (Main et al., 2015).

Углубленное исследование CNV вокруг этих пяти генов выявило убедительные доказательства того, что они обеспечивают селективное преимущество.Во-первых, некоторые из аллелей CNV были обнаружены с высокой частотой и в нескольких популяциях. Во-вторых, аллели CNV последовательно продемонстрировали доказательства того, что они находились под положительным отбором, поскольку гомозиготность гаплотипов была расширена для CNV дальше, чем для дикого типа. гаплотипы. Доказательства положительного отбора были также обнаружены в CNV, где оценка EHH не могла быть рассчитана. Cyp9k1_Dup11, который существует как в виде дупликаций, так и в виде троек и, таким образом, не может быть фазирован на каркас гаплотипа для гомозиготности расчет, был последовательно обнаружен в тех же выборках, что и гаплотип большого выборочного свипа около Cyp9k1 в An.gambiae из Буркина-Фасо, Гвинеи и Ганы, что повышает вероятность того, что этот CNV является фокусом выборочной проверки. Хотя Cyp9k1_Dup11 может находиться в неравновесном сцеплении с другими мутациями, высокая частота тройной версии Cyp9k1_Dup11 по сравнению с дублированной версией, обе из которых связаны с развернутым кластером гаплотипов, предполагает, что более высокий порядок Усиления Cyp9k1 обеспечивают избирательное преимущество.Изменения частот аллелей на разных уровнях амплификации в этой CNV потребуют необходимо контролировать, чтобы определить, полностью ли тройное дублирование заменяет дублирование.

В настоящее время одним из основных факторов, рассматриваемых в программах борьбы с малярией, является ценность инвестиций в надкроватные сетки следующего поколения, которые включают пиперонилбутоксид (PBO), которые препятствуют опосредованной цитохромом P450 устойчивости к инсектицидам, и которые были показаны чтобы эффективно снижать численность комаров и заболеваемость малярией по крайней мере в некоторых регионах (Protopopoff et al.2018). Однако в большинстве случаев неясно, является ли местная устойчивость к инсектицидам опосредованной цитохромом P450, частично из-за отсутствие молекулярных маркеров для определения метаболической резистентности. Наши результаты указывают на районы, где возможно появление комаров. для проявления устойчивости на основе цитохрома P450. Например, CNV в кластере Cyp6aa / p в основном были обнаружены в An. coluzzii из Буркина-Фасо, Кот-д’Ивуара и Ганы, тогда как CNV в Cyp9k1 в основном были обнаружены в An.gambiae из Буркина-Фасо, Ганы и Гвинеи. Хотя присутствие CNV цитохрома P450 указывает на вероятное присутствие цитохрома Р450-опосредованная резистентность, мы подчеркиваем, что их отсутствие не обязательно означает, что такой резистентности не существует. Другие формы генетической изменчивости, которые могут увеличивать экспрессию генов, такие как мутации в регуляторной области (Schmidt et al. 2010), нуждаются в исследовании, чтобы получить полный набор молекулярных маркеров для обнаружения метаболической устойчивости.

Все, кроме одного из 11 аллелей CNV в кластере Gstu / e , включали Gste2 , что указывает на то, что это основная цель амплификации гена в этом кластере. Учитывая совокупность доказательств связи Gste2 с ДДТ и устойчивостью к пиретроидам у нескольких видов – An. gambiae (Mitchell et al., 2014), An. funestus (Riveron et al. 2014a), Aedes aegypti (Lumjuan et al. 2011) – фокус амплификации этого гена, вероятно, связан с его важностью для устойчивости.

Дупликация Gstue_Dup1 в Буркина-Фасо происходит на фоне SNP Gste2 _114T, связанного с устойчивостью к ДДТ у An. gambiae (Mitchell et al., 2014). Таким образом, дупликация может служить для увеличения дозировки Gste2 , детоксицирующая активность которого уже повышена мутацией 114T. В качестве альтернативы роль Gstue_Dup1 может быть чтобы компенсировать любые негативные эффекты фитнеса 114T.Хотя нарушение активности Gste2 может быть компенсировано увеличением экспрессии гена, Gstue_Dup1 гомогенен для 114T, исключая возможность компенсации за счет спаривания мутантных и аллелей дикого типа, как обнаружено в гетерогенных дупликациях Ace1 (Assogba et al. 2015).

В кластере Cyp6aa / p только пять из 15 CNV включали Cyp6p3 , и они были обнаружены с заметной частотой только в An.coluzzii из Кот-д’Ивуара. Напротив, 13 из 15 CNV включали Cyp6aa1 , с высокими частотами CNV, обнаруженными в An. coluzzii из Буркина-Фасо, Кот-д’Ивуара и Гвинеи, а в An. gambiae из Уганды. Кроме того, пять высокочастотных CNV, которые включают Cyp6aa1 (Cyp6aap_Dup1, Cyp6aap_Dup7, Cyp6aap_ Dup10, Cyp6aap_Dup14, Cyp6aap_Dup15), все демонстрируют свидетельства положительного отбора. Хотя Cyp6aa1 привлек значительно меньше внимания, чем Cyp6p3 , он ранее был вовлечен в устойчивость к инсектицидам.Экспрессия Cyp6aa1 выше в популяциях An. gambiae и An. coluzzii , которые устойчивы к пиретроидам и ДДТ по сравнению с чувствительными лабораторными колониями (Kwiatkowska et al. 2013; Thomsen et al. 2014). Также имеются убедительные доказательства связи между Cyp6aa1 и устойчивостью к инсектицидам у двух родственных видов. В ан. funestus, экспрессия Cyp6aa1 выше у комаров, переживших воздействие перметрина, по сравнению с чувствительным штаммом (Riveron et al.2014b; Ибрагим и др. 2018), и было показано, что белок метаболизирует пиретроиды и управляет сопротивляемостью при экспрессии в Drosophila (Ibrahim et al. 2018). В ан. minimus , ортолог Cyp6aa1 активируется в результате отбора на устойчивость к дельтаметрину (Rodpradit et al. 2005), и было показано, что белок метаболизирует пиретроиды (Duangkaew et al. 2011). Способность Ан. gambiae Cyp6aa1 для метаболизма инсектицидов эмпирически не тестировалось, хотя теоретическое моделирование предполагает, что это должно эффективно связываются с перметрином и дельтаметрином (Ibrahim et al.2018). Высокая частота амплификаций в Cyp6aa1 и связанные с ними сигналы отбора предполагают, что важность этого гена для устойчивости к инсектицидам у Ан. gambiae и An. coluzzii был недооценен.

В заключение, наши результаты показывают ключевую роль CNVs в адаптивном ответе на сильное и недавнее давление отбора. В популяциях из комаров Anopheles по всей Африке, гены, участвующие в метаболической устойчивости к инсектицидам, были дублированы, и эти дупликации были доведены до высоких частот благодаря положительному отбору.Эти результаты подчеркивают CNV как форму вариации, которая может действовать. как быстрый ответ на селективное давление, требующее изменения уровней экспрессии. Широкое распространение CNV как средства метаболической устойчивости к инсектицидам усиливает необходимость разработки новых инсектицидных соединений для борьбы с перекрестной устойчивостью и подчеркивает потенциальную ценность надкроватных сеток, обработанных ПБО. Наши результаты также выдвигают на первый план Cyp6aa1 как ген, который требует более тщательного изучения на предмет его важности для An.gambiae , которого до сих пор не уделяли должного внимания его геномному соседу Cyp6p3 . В более широком смысле, акцент на SNP в An. gambiae исследования устойчивости к инсектицидам позволили выявить и избирательно распространить мутации числа копий в ключевом инсектициде. гены устойчивости остаются незамеченными. Наши результаты демонстрируют важность наблюдения и расследования CNV в этих гены. С этой целью описания точек останова, представленные в нашем исследовании, позволят проверять и контролировать эти CNV в популяции комаров, что позволяет отслеживать распространение этих мутаций и обеспечивает основу для будущих исследований. исследуя их профиль сопротивления.

Методы

Отбор популяционных проб и полногеномное секвенирование

Мы проанализировали данные по 1142 отдельным выловленным в дикой природе экземплярам An. gambiae и An. coluzzii , собранные и секвенированные на Фазе 2 Ag1000G (https://www.malariagen.net/data/ag1000g-phase-2-ar1) (метаданные представлены в дополнительных данных S10).Экземпляры собраны на стоянках в 13 африканских странах (Ангола An. Coluzzii n = 78, Буркина-Фасо An. Coluzzii n = 75, Буркина-Фасо An. Gambiae n = 92, Камерун An. Gambiae n = 297, Кот-д’Ивуар An. Coluzzii n = 71, Экваториальная Гвинея (Bioko) An. Gambiae n = 9, Габон An. Gambiae n = 69, Гана An. Coluzzii n = 55, Гана An. Gambiae n = 12, Гвинея An. Coluzzii n = 4, Гвинея An.gambiae n = 40, Гвинея-Бисау (смешанное происхождение) n = 91, Кения (неопределенное происхождение) n = 48, Mayotte An. gambiae n = 24, Гамбия (смешанное происхождение) n = 65, Уганда An. gambiae n = 112). Отдельные образцы секвенировали с использованием платформы Illumina HiSeq для получения считываний парных концов 100 пар оснований с мишенью. покрытие 30 ×. Более подробная информация о выборке популяций, подготовке образцов, секвенировании, выравнивании, идентификации видов, и производство данных сообщается в другом месте ( Anopheles gambiae 1000 Genomes Consortium 2017).Метаданные для всех образцов, а также подробные методы сбора для популяций, не включенных в вышеупомянутую публикацию, представлены в дополнительных методах SM1 и дополнительных данных S10.

Расчет и нормализация покрытия

Для каждого человека мы использовали программный пакет pysam (https://github.com/pysam-developers/pysam) для подсчета количества выровненных чтений (покрытия) в неперекрывающихся окнах длиной 300 п.н. по ядерному геному.Положение каждое чтение считалось начальной точкой его выравнивания; таким образом, каждое чтение учитывалось только один раз. Покрытие секвенированием может быть смещены вариациями в локальном нуклеотидном составе. Чтобы учесть это, мы вычислили нормализованное покрытие из чтения подсчет основан на ожидаемом охвате каждого окна с учетом его содержания GC (Абызов и др., 2011). Для каждого окна размером 300 п.н. мы вычислили процент (G + C) нуклеотидов до ближайшей процентной точки в пределах эталона. последовательности, а затем разделили счетчики считываний в каждом окне на среднее количество считываний по всем аутосомным окнам с тем же (G + C) в процентах.Чтобы минимизировать влияние изменения количества копий при вычислении этих нормирующих констант, мы исключили окна из расчета среднего числа считываний, для которых предыдущий анализ доступности генома обнаружил доказательства чрезмерно высокий или низкий охват или неоднозначное выравнивание (окна с доступными основаниями <90% в соответствии с фазой Ag1000G 2 карта доступности генома, именуемая «окнами доступа») (https: // www.malariagen.net/data/ag1000g-phase-2-ar1). Затем нормализованные значения охвата были умножены на коэффициент 2, так что области генома с нормальной диплоидной копией число должно иметь ожидаемое нормализованное покрытие 2.

Прежде чем исследовать нормализованные данные о покрытии для доказательства вариации количества копий, мы применили два фильтра, чтобы исключить окна для которых покрытие может быть ненадежным показателем количества копий.Первый фильтр удалил окна, в которых было выполнено> 2% чтений. выровнено с качеством сопоставления 0 (дополнительный рис. S13), что указывает на то, что считывание отображается неоднозначно и может быть сопоставлено с одинаковым успехом в другом геномном местоположении. Этот фильтр удалил 159,587 (20,8%) из 768,225 окон. Второй фильтр удалял окна, для которых процентное содержание (G + C) был крайним и редко представлен в доступной ссылочной последовательности, то есть менее 100 доступных окон с тот же процент (G + C), потому что небольшое количество окон делает расчет нормирующей константы (G + C) ненадежным.Этот фильтр удалил 13 484 (2,2%) из оставшихся 608 638 окон. Окна, оставленные для анализа, назывались «отфильтрованными» окна. ”

Обнаружение вариаций числа копий в масштабе всего генома

Чтобы определить наиболее вероятное состояние числа копий (CNS) в каждом окне каждого индивидуума, мы применили гауссовский HMM к индивидуальному нормализованные оконные данные о покрытии, аналогичные подходу Miles et al.(2016) и Leffler et al. (2017) (подробнее см. Дополнительные методы SM2). Поскольку нас в первую очередь интересуют амплификации, а не делеции, мы получили необработанный набор вызовов CNV для каждого образец путем обнаружения смежных серий по крайней мере пяти окон с усиленной ЦНС (ЦНС> 2 или ЦНС> 1 для хромосомы X у мужчин).

CNV фильтрация

Из необработанного набора вызовов CNV мы создали отфильтрованный по качеству список вызовов CNV.Сначала мы удалили образцы с очень высоким покрытием. дисперсия, потому что высокая дисперсия может привести к ошибочным вызовам CNV. Таким образом, мы удалили 27 выборок, для которых дисперсия нормализованное покрытие было больше 0,2 (дополнительный рисунок S14), оставив 1115 образцов для дальнейшего анализа.

Затем мы применили два фильтра к необработанным вызовам CNV из этих 1115 выборок. Для первого фильтра мы вычислили вероятность для каждый необработанный вызов CNV как для состояния номера копии, предсказанного HMM, так и для нулевой модели с номером копии = 2, и удален CNV требует, для которых отношение правдоподобия было <1000 (дополнительные методы SM3).Для второго фильтра мы удалили CNV с низкими частотами популяции. Для этого необходимо сопоставить необработанные вызовы CNV. чтобы можно было идентифицировать одну и ту же CNV у разных людей. Мы классифицировали любые два CNV как идентичные, если точки останова предсказанные по их количеству копий, переходы состояний происходили в пределах одного окна друг от друга. Затем мы удалили CNV, которые не были обнаруживается не менее чем у 5% особей как минимум в одной популяции (или как минимум у трех особей для популяций меньше, чем 40).

Мы определили чувствительность и специфичность метода обнаружения CNV, используя моделирование, в котором значения охвата были случайным образом перетасовывались по окнам генома. Подробности этого моделирования описаны в дополнительных данных S11.

CNV в типах хроматина

Области гетерохроматина и эухроматина взяты из Sharakhova et al.(2010). CNV считался гетерохроматическим, если какая-либо его часть перекрывала области гетерохроматина. Мы провели симуляции чтобы определить, были ли обнаруженные нами CNV равномерно распределены между гетерохроматином и эухроматином. За каждый пробег моделирования, мы случайным образом перераспределяли начальные позиции каждого обнаруженного CNV, сохраняя количество отфильтрованных окон покрытые CNV без изменений, и рассчитали количество CNV, которые перекрывают гетерохроматин.Это моделирование было выполнить 10 000 раз, чтобы получить распределение нулевой модели. Двусторонние значения P были получены путем расчета доли моделирования, в результате которого было получено, по крайней мере, столько же гетерохроматических CNV, сколько наблюдаемых в реальных данных и умножая это на два.

Обнаружение дупликаций генов и анализ обогащения генов

Чтобы определить гены, содержащиеся в каждом CNV, мы сравнили начальную и конечную точки CNV с начальной и конечной точками. всех генов, перечисленных в AgamP4.Аннотации 2 генов ( Anopheles-gambiae-PEST_BASEFEATURES_AgamP4.2.gff3 ). Начальные / конечные точки каждого CNV были рассчитаны как медиана начальных / конечных точек всех необработанных вызовов CNV, которые были соответствует этому. Чтобы сохранить только гены, по которым были доступны хорошие данные об охвате, мы оставили только гены, содержащие не менее 50% фильтрованных окон. Мы классифицировали сохраненный ген как скопированный CNV, если все отфильтрованные окна внутри гена находились внутри CNV.Чтобы определить, содержат ли обнаруженные нами CNV больше генов, чем ожидалось случайно, мы провели моделирование. как описано для исследования обогащения для типов хроматина, на этот раз подсчитывая количество CNV, которые содержат не менее один ген. Мы также повторили это моделирование после исключения гетерохроматических областей путем рандомизации только эухроматических областей. CNVs и предотвращение их случайного расположения в гетерохроматине.

Мы определили гены, которые потенциально могут участвовать в метаболической устойчивости посредством детоксикации («гены метаболической детоксикации»). путем нахождения генов, аннотации которых содержали термины «P450», «глутатион-S-трансфераза» или «карбоксилэстераза» в AgamP4 аннотации стенограммы ( Anopheles-gambiae-PEST_ TRANSCRIPTS_AgamP4.2.fa ). Мы провели моделирование, чтобы определить, обогащены ли гены, копируемые CNV, генами метаболической детоксикации.За каждый пробег моделирования, мы рандомизировали каждый генный CNV, перераспределяя гены, охватываемые CNV, сохраняя количество последовательных гены, покрываемые каждым CNV без изменений, и рассчитали количество CNV, которые включали по крайней мере один метаболический детокс-ген. Этот моделирование было выполнено 10 000 раз, чтобы получить распределение нулевой модели. Двусторонние значения P были получены путем расчета доли моделирования, в результате которого было получено, по крайней мере, столько же генных CNV, содержащих детокс гены, наблюдаемые в реальных данных и умноженные на два.

GO генов, включенных в CNVs, был выполнен с использованием пакета topGO в R (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/topGO.html; R Core Team 2015). Частота ложного обнаружения была рассчитана на основе значений P с использованием пакета R fdrtool (https://cran.r-project.org/web/packages/fdrtool/index.html).

Идентификация аллелей CNV в кандидатных локусах метаболической устойчивости к инсектицидам

Мы подробно охарактеризовали различные события дупликации (аллели CNV) в пяти кластерах генов, представляющих особый интерес ( Cyp6aa1 – Cyp6p2 , Gstu4 – Gste3 , Cyp6m2 – Cyp60003 Cyp6m4 Cyp6z1 , Cyp9k1 ), используя свои уникальные паттерны несогласованных пар чтения и считываний, пересекающих точку останова CNV (считывание точки останова, см.рис.3; Дополнительные методы SM4). Мы вручную проверили пять интересующих областей во всех 1142 выборках, чтобы выявить паттерны несогласованности и точки останова. считывания («диагностические считывания»), последовательно связанные с изменениями в охвате (дополнительные рисунки S2 – S5). Начальная и конечная точки каждого аллеля CNV обычно могут быть точно определены считыванием точки останова, а в противном случае определяется несогласованными парами чтения или точкой изменения покрытия (дополнительные данные S4 – S7).После того, как диагностические считывания были идентифицированы для аллеля CNV, мы зарегистрировали присутствие этого аллеля во всех образцах с не менее двух вспомогательных диагностических чтений.

Чтобы идентифицировать TE, которые могут быть вовлечены в CNV, которые, по-видимому, не являются тандемными инверсиями или тандемными дупликациями, мы взяли мягко обрезанные базы из сопоставления чтения с точками останова этих CNV и использовали несмежные мегабласти для сравнения их против базы данных Repbase (версия 24.10) от Ан. gambiae мобильных и повторяющихся элементов (www.girinst.org/repbase/ [Bao et al. 2015]).

Обнаружение сигналов отбора по аллелям CNV

Мы использовали поэтапные гаплотипы для расчета попарно общей длины гаплотипа и EHH для каждого аллеля CNV (Sabeti et al. 2002), используя только SNP за пределами региона, в котором были обнаружены CNV. Расчеты EHH были выполнены с использованием пакета Python scikit-allel (https: // zenodo.org / record / 3238280).

гаплотипов в области Cyp9k1 были получены с scikit-allel с использованием первых 1000 SNP на центромерной стороне Cyp9k1 (теломерная сторона этого гена имеет низкие уровни доступности). Матрица расстояний между гаплотипами была вычислена с использованием доля доступных SNP, которые различались между попарными комбинациями гаплотипов. Это использовалось для выполнения иерархических кластеризация с кластерами гаплотипов, определенными с использованием порогового значения 0.001.

Статистика

Статистический анализ проводился в R (R Core Team 2015). Таблицы непредвиденных обстоятельств были проанализированы с помощью точного критерия Фишера. Если размер выборки был слишком большим для точного теста Фишера, P -значения были получены с использованием опции «simulated.p.value» с 10 ⁶ повторами.

Оценка числа копий, специфичных для аллелей, и фазирование генотипов CNV на каркасы гаплотипов Ag1000G

Чтобы определить количество аллель-специфичных копий в образце, мы оценили изменение покрытия, связанное с каждым аллелем CNV. (Дополнительный рис.S15; Дополнительные методы SM5). Таким образом, даже когда перекрывающиеся аллели CNV присутствовали в одном образце, мы обычно могли определить количество копии каждого аллеля.

Для однокопийных CNV можно определить генотип образца по количеству копий (число копий 1 указывает гетерозигота, число копий 2 указывает на гомозиготу по CNV). Для CNV более высокого порядка это невозможно, потому что дупликацию гетерозиготы нельзя отличить от дупликации гомозиготы.Поэтому мы применили два фильтра, чтобы сохранить только однокопийные аллели CNV. Первый фильтр удалил аллели CNV, для которых было обнаружено, что число копий, специфичных для аллелей, подняться выше 2 в данных (если только один образец поднялся до 2,5, мы предположили, что это может быть ошибкой, и классифицировали это как 2). Этот фильтр удалил пять аллелей CNV (Cyp6aap_Dup11, Gstue_Dup2, Gstue_Dup8, Cyp9k1_Dup11, Cyp9k1_Dup15). Для второй фильтр, мы классифицировали каждый образец как гомозиготу дикого типа, гетерозиготу или гомозиготу CNV на основе их количества копий, а затем удалили аллели CNV, которые не соответствовали ожиданиям Харди-Вайнберга в популяциях, в которых они были найдены.Этот фильтр удалил четыре аллеля CNV (Cyp6aap_Dup4, Gstue_Dup5, Gstue_Dup7, Cyp9k1_Dup10). Три аллеля CNV (Cyp9k1_Dup7, Cyp9k1_Dup13 и Cyp9k1_Dup14) также были исключены из-за трудностей с определением аллель-специфичного номера копии (Supplemental Data S7). В одном случае (Cyp6m_Dup1) было обнаружено, что у всех людей число копий равно 2, что указывает на то, что CNV является троекратным, без дублирования в популяции. Таким образом, этот CNV был сохранен, и все образцы, содержащие CNV, были классифицированы. как гетерозиготный.

CNV, прошедшие оба фильтра, были фазированы на каркасы гаплотипов Ag1000G Phase 2 с использованием программного обеспечения MVNcall v1.0. (Menelaou and Marchini 2013), используя параметры по умолчанию, кроме установки λ = 0,1, чтобы гарантировать, что ни один из входных вызовов генотипа CNV не был изменен во время фазирования. Для каждого из пяти кластеров генов фазирование было выполнено с использованием 200 неядерных SNP по обе стороны от области, в которой были обнаружены CNV, что позволило избежать включение SNP, найденных в любой из CNV.Гаплотипы, содержащие более одного аллеля CNV, были редкими и, следовательно, исключены из последующих расчетов гомозиготности гаплотипов.

Благодарности

Мы благодарим трех анонимных рецензентов за полезные комментарии к этой рукописи. Эта работа была поддержана Wellcome Trust (0 / Z / 09 / Z; 0 / Z / 09 / Z; 098051), Совет медицинских исследований Соединенного Королевства (MR / P02520X / 1; MR / M006212 / 1) и Национальный институт Аллергия и инфекционные заболевания ([NIAID] R01-AI116811).Авторы полностью несут ответственность за содержание и не обязательно представляют официальную точку зрения NIAID или Национальных институтов здравоохранения (NIH).

Вклад авторов: E.R.L., A.M., M.K.N.L., D.P.K., D.W. и M.J.D. разработал исследование. E.R.L., A.M., N.J.H. и C.S.C. провели анализ. Консорциум Ag1000G провел сбор, подготовку, секвенирование и первичный анализ образцов.E.R.L., A.M., D.W., и M.J.D. написал рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

• Поступило 30.10.2018 г.
• Принята к печати 26 июня 2019 г.

Какие варианты количества копий?

У каждого человека есть уникальные варианты в своем геноме, и многие из них безвредны, но какие типы могут влиять на наше здоровье и как они возникают?

Большие части генома человека состоят из повторяющихся последовательностей.Некоторые из них представляют собой короткие последовательности из двух или трех пар оснований («буквы» ДНК), повторяющиеся десятки или сотни раз; другие могут включать дупликации целых генов или более крупных участков хромосом. Варианты числа копий (CNV) – это случаи, когда количество повторов варьируется от человека к человеку и может составлять почти 10% генома человека.

Многие из этих вариантов, по-видимому, не влияют на здоровье, но некоторые связаны с болезнью или могут иметь другие клинически значимые эффекты. Два типа CNV – тринуклеотидные повторы и дупликации целых генов – могут иметь особенно большое влияние на здоровье пораженных людей.

Тринуклеотидные повторы и болезнь

Одним из наиболее известных примеров вызывающей заболевание CNV является болезнь Хантингтона, которая вызывается повторяющейся последовательностью из трех пар оснований (известной как тринуклеотидный повтор) в конце кодирующей области гена HTT . .

У здоровых людей последовательность «CAG» повторяется от 10 до 35 раз, но люди с 40 или более повторами будут поражены болезнью Хантингтона. Возможно большое количество повторов (более 200), а большее количество повторов, особенно более 60, связано с более ранним началом заболевания.Болезнь показывает пониженную пенетрантность у людей с 36 до 39 повторами.

Тринуклеотидные повторы также ответственны за синдром ломкой Х-хромосомы и связанные с ним состояния (известные как «предварительные мутации»), которые возникают из-за повтора «CGG» в некодирующей области гена FMR1 .

У здоровых людей будет от 5 до 40 повторов, но состояние здоровья проявляется у людей с большим количеством повторов. Те, у кого от 55 до 200 повторов, имеют преждевременную мутацию и подвержены риску различных клинических расстройств, включая проблемы развития нервной системы, психические расстройства и преждевременную менопаузу.Те, у кого более 200 повторов, имеют синдром ломкой Х-хромосомы. Такое количество повторов приводит к инактивации промотора гена и выключению гена, даже если кодирующие области остаются неизменными.

Дупликации целых генов: значение для здравоохранения

CNV также могут включать в себя повторение целых генов в геноме. Одним из примеров является ген CYP2D6 , который кодирует цитохром P450 у человека. P450 – это фермент, важный для расщепления веществ, не вырабатываемых организмом, в том числе лекарств.

Наряду с наличием нескольких различных аллелей, которые могут вызывать вариации активности P450, у некоторых людей также есть дупликации этого гена, что может сделать их сверхвысокими метаболизаторами. Это может иметь значительные клинические последствия, поскольку эти люди будут реагировать на дозы лекарств совершенно иначе, чем другие в популяции.

Во многих случаях сверхвысокие метаболизаторы расщепляют лекарства быстрее, поэтому обычная дозировка будет неэффективной для пациента.P450 участвует в метаболизме нескольких антидепрессантов и нейролептиков, что делает эту область интересной при назначении психиатрических препаратов.

Однако некоторые препараты, такие как кодеин, используют P450. Это соединения (известные как пролекарства), которые организм превращает в активную форму – в случае кодеина – в морфин. Для сверхвысоких метаболизаторов этот эффект усиливается, так что в конечном итоге у пациента может быть гораздо более высокая концентрация морфина в кровотоке, чем предполагал врач.

Чтобы узнать больше о типах геномных вариантов, которые могут повлиять на здоровье человека, прочитайте нашу поясняющую статью «Различные типы вариантов: что такое геномные вариации?»

–

Вариация числа копий гена не отражает структуру или экологический отбор в двух недавно разошедшихся калифорнийских популяциях Suillus brevipes | G3: Гены | Геномы

Abstract

Было показано, что вариация числа копий гена у разных людей отслеживает структуру популяции и является источником адаптивных генетических вариаций со значительным влиянием на приспособленность.В этом исследовании мы сообщаем о противоположных результатах для обоих прогнозов, основанных на анализе вариантов числа копий гена (CNV) Suillus brevipes , микоризного гриба, адаптированного к прибрежным и горным местам обитания в Калифорнии. Чтобы оценить, отражают ли вариации числа копий гена структуру популяции и отбор у этого вида, мы исследовали две ранее изученные локально адаптированные популяции, показывающие высокодифференцированную геномную область, включающую ген, который, по прогнозам, придает солеустойчивость.Кроме того, мы исследовали, различалось ли количество копий в генах, связанных с солевым гомеостазом, между двумя популяциями. Хотя мы обнаружили множество примеров областей CNV в геномах особей S. brevipes , мы также обнаружили, что CNV не восстанавливают структуру популяции, и известные гены, связанные с солеустойчивостью, не подвергались отбору среди прибрежной популяции. Наши результаты контрастируют с предсказаниями CNV, совпадающими с дивергенцией однонуклеотидного полиморфизма, и показали, что CNV генов солевого гомеостаза не подвергаются отбору в S.Крестьянка .

Варианты числа копий (CNV) – это гены или области генома различного размера с различным числом копий у разных людей. Различия в количестве копий могут возникать из-за геномных перестроек (таких как неаллельная гомологичная рекомбинация и негомологичное соединение концов (Gu et al. 2008; Conrad et al. 2010; Lupski and Stankiewicz 2005), остановка вилок репликации (Hull et al. 2017) и циркуляризация ДНК (Møller et al. 2015).CNV могут быть специфичными для популяции и иметь большое влияние на динамику популяции. Например, было показано, что отбор эффективно удаляет вредные CNV в больших популяциях малярийных паразитов и менее эффективно – в меньших популяциях (Cheeseman et al. 2015). Структура популяции и истории отбора могут быть восстановлены с помощью анализа CNV на уровне популяции. Было показано, что у людей CNV отражают структуру популяции, обнаруженную по дивергенции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) (Jakobsson et al. 2008; Конрад и др. 2010; Редон и др. 2006). Несмотря на то, что CNV отражают паттерны популяционной структуры, полученные из однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) у многих организмов, включая человека, в траве Brachipodium distachyon (Gordon et al. 2017), у грибковых патогенов Zymoseptoria tritici и Asum. (Hartmann, Croll, 2017; Zhao, Gibbons, 2018), у коренного китайского крупного рогатого скота, адаптированного к высокогорью (Zhang et al. 2020), это не всегда так. Например, исследование популяции американских омаров через градиент температуры на входе, показывающее отсутствие структуры популяции на основе SNP, показало, что CNV являются лучшими предикторами отбора, чем SNP, и несоответствие между паттерном, полученным с помощью SNP и CNV (Dorant et al. 2020).

Обнаружение CNV у индивидуумов важно, потому что варианты, вызывающие резкие изменения фенотипов, могут быть адаптивными и иметь важные эволюционные последствия.Отбор может модулировать дозировку белка (где увеличенное число копий приводит к увеличению количества продукта гена в клетке) или вызывать функциональную дивергенцию между копиями генов, приводящую к дифференцированно адаптивным фенотипам (Schrider and Hahn 2010; Kondrashov 2012). CNVs и, в частности, размножение генов, как известно, важны для адаптации к окружающей среде (Oh et al. 2012). Известно, что вариация числа копий генов участвует в адаптации к окружающей среде, характеризующейся экстремальными температурами, токсичными тяжелыми металлами и высокой соленостью (Кондрашов, 2012; Oh et al. 2012). Например, расширение семейства генов гликопротеинов-антифризов позволяет треске выдерживать отрицательные температуры в Антарктике (Chen et al. 2008), а увеличенное количество копий генов, связанных с термостойкостью, придает термостойкость штаммам Escherichia coli ( Риле и др. 2001). Эволюция толерантности к тяжелым металлам также может происходить через CNV (Oh et al. 2012), включая увеличение количества копий и уровней экспрессии генов гомеостаза металлов у растений (Craciun et al. 2012; Talke et al. 2006) и грибов (Ruytinx et al. 2019; Bazzicalupo et al. 2020). Толерантность к соли также может быть связана с CNV гена-переносчика ионов и была зарегистрирована у нескольких растений (Huang et al. 2008; Wu et al. 2012) и у дрожжей Saccharomyces cerevisiae , где повышенные уровни плоидности и экспрессия связаны с толерантностью к высокой солености (Dhar et al. 2011).

У грибов отсутствуют легко поддающиеся измерению фенотипы, что затрудняет изучение адаптации грибов к окружающей среде (Branco et al. 2017; Бранко 2019). Одним из распространенных подходов к обнаружению геномных признаков отбора является использование как сканирования генома для отбора, так и корреляций между геномами и окружающей средой, что подчеркивает важность конкретных генов в способности грибов сохраняться в определенных средах. По большей части этот подход чаще всего применялся к данным SNP (Ellison et al. 2011; Gladieux et al. 2015; Branco et al. 2015; Branco et al. 2017). Однако, учитывая эволюционную важность CNV, сканирование генома, нацеленное на вариацию числа копий, также было полезно для обнаружения адаптивных вариантов у грибов, таких как винные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae , патоген человека Cryptococcus gattii и микоризный гриб . Suillus luteus (Steenwyk, Rokas, 2017; Steenwyk, Rokas, 2018; Steenwyk, et al. 2016; Bazzicalupo et al. 2020).

Здесь мы исследуем, отражает ли вариация числа копий гена паттерны структуры популяции и отбора, выявленные при сканировании генома по расхождению SNP у Suillus brevipes , широко распространенного микоризного гриба, связанного с соснами. В предыдущей работе были задокументированы дифференцированные популяции из прибрежных и горных регионов Калифорнии, адаптированные к различным климатическим условиям и условиям солености (Branco et al. 2015; Branco et al. 2017), с дифференцировкой SNP, выявляющей сильную сигнатуру отбора около гена, связанного с солеустойчивостью (предсказанный как Nha-1 -подобный, Na ⁺ / H ⁺ -антипортер). Кроме того, не было обнаружено вариаций SNP в этом гене у прибрежных особей, что убедительно свидетельствует о селективном поиске адаптивных аллелей, позволяющих колонизировать соляную среду в прибрежной Калифорнии. Сообщается, что гомологов Nha-1 важны для толерантности к соли у других организмов, включая повышенные уровни экспрессии Nha-1 у Arabidopsis thaliana , что позволяет выжить при высоких концентрациях натрия (Apse et al. 1999) и Nha-1 мутаций, передающих солеустойчивость у дрожжей (Nass et al. 1997). Кроме того, имеются данные о солеустойчивых штаммах дрожжей, имеющих множественные копии Nha-1 (Prior et al. 1996). Мы предположили, что CNV в двух популяциях S. brevipes отражают как популяционную структуру, так и модели отбора, полученные из анализа SNP, и преобладают в определенных геномных регионах, связанных с солевым гомеостазом. В частности, мы исследовали, восстанавливают ли CNV ранее описанную дифференциацию популяций между прибрежной и горной Калифорнией и участвуют ли наиболее дифференцированные CNV гены солевого гомеостаза, включая Nha-1 -подобный ген.Мы обнаружили, что у грибов обнаруживается много CNV, однако эти CNV не смогли воспроизвести популяционную структуру S. brevipes и признаки отбора, предсказанные анализом SNP.

Методы

Оценки числа копий гена на индивидуальную и популяционную дифференциацию числа копий гена

Мы оценили вариацию числа копий гена на основе обработанных считываний Illumina 27 полных геномов S. brevipes из прибрежных (11 особей) и горных ( 16 человек) Популяции Калифорнии, ранее проанализированные в Branco et al. (2015). Считанные данные доступны в GenBank (см. Бранко и др. (2015) для кодов SRA отдельных лиц и эталонного генома). Чтобы обнаружить вариацию числа копий в популяциях, мы оценили количество копий для окон 250 пар оснований у каждого человека с помощью программного обеспечения Control-FreeC (Barillot et al. 2011). Suillus brevipes – дикариотический гриб, что означает, что в одной и той же клетке обитают два гаплоидных генома, поэтому мы предположили диплоидность наших образцов и последовали примеру Steenwyk et al. (2016) для других настроек программного обеспечения. Control-FreeC сопоставляет считанные данные с эталонным геномом, нормализует их, предполагая диплоидность, и оценивает отклонения на основе количества считываний. Только гены, присутствующие в эталоне, оцениваются на предмет отклонений числа копий, а гены, отсутствующие в образце, считаются потерями. Мы определяем «выигрыш» как регионы, которые, по оценкам, имеют более двух копий, и «потери» или «отсутствия» как регионы, которые, по оценкам, имеют одну или ноль копий гена. Этот метод, основанный на нормализованном количестве считываний, не позволяет нам по-настоящему оценить, находятся ли копии определенного гена в тех же участках генома или в других частях генома.Чтобы идентифицировать регионы, дифференцированные по количеству копий, мы вычислили величину дисперсии копий, используя V _ST после Steenwyk et al. (2016) (код с формулой V _ST доступен по адресу https://github.com/abazzical/sbrevCNV). Учитывая, что эталонный геном довольно фрагментирован (Branco et al. 2015), мы приводим результаты только для 100 крупнейших каркасов генома для всех последующих анализов. Общая длина референсного генома составляет 52 222 250 п.н., а скаффолды 1-100 представляют 54.7% (28 583 750 б.п.). Поскольку каркасы в эталонных геномах пронумерованы в соответствии с их размером, мы наблюдали увеличение значений V _ST по мере уменьшения размера каркаса, что, возможно, указывает на некоторую систематическую ошибку в оценке числа копий, когда эталонный каркас более фрагментирован. Поэтому мы решили использовать только первые 100 каркасов (рис. S1-2).

Кластеризация индивидуумов на основе полногеномных вариантов числа копий (CNV)

Чтобы выяснить, восстанавливает ли вариация числа копий дифференциацию популяции, обнаруженную в (Branco et al. 2017; Бранко и др. 2015), мы провели анализ главных координат (PCoA) на основе оценок числа копий гена. Цель состояла в том, чтобы оценить, сгруппированы ли отдельно представители прибрежных и горных популяций, как видно из данных SNP (Branco et al. 2015; Branco et al. 2017). С этой целью мы использовали матрицы оценок количества копий гена для каждого отдельного гена в окнах 250 п.н. по всем образцам с помощью программного обеспечения Bedtools (Quinlan and Hall 2010; Quinlan 2014).Мы составили четыре матрицы расстояний, отфильтровав исходную матрицу разными способами. Одна матрица включала все CNV областей кодирующей последовательности ДНК (CDS), вторая включала только верхний 1% дифференцированных CDS. Мы также отфильтровали матрицы на основе количества копий: третья матрица включала только области, которые имели хотя бы одно «усиление», а четвертая матрица включала только области, которые имели хотя бы одно нулевое значение. Все матрицы расстояний и PCoA были сгенерированы с использованием пакета ape (Paradis and Schliep 2018) в R (R Core Team 2014).Для сравнения размеров и количества горных и прибрежных CNV мы использовали критерий суммы рангов Вилкоксона. Кроме того, чтобы визуализировать, насколько люди похожи друг на друга, мы использовали матрицу расстояний, используемую в PCoA для всех генов с CNV, чтобы построить кластерное дерево с настройками по умолчанию R package ape (Paradis and Schliep 2018). . Затем мы смогли сравнить наше дерево кластеризации с деревом штата Нью-Джерси на основе SNP из (Branco et al. 2015).

Обогащенный анализ онтологии генов для 1% наиболее различающихся CNV

Чтобы оценить, были ли гены, дифференцированные по верхнему CNV, обогащены генами, участвующими в солеустойчивости, мы провели анализ обогащения онтологии генов (GO) на 1% верхних отклоненных CNV между два S.brevipes популяций. Мы использовали термины GO на основе аннотированного эталонного генома S. brevipes (Бранко и др. 2015) и использовали приложение ClueGO (Кириловский и др. 2009) в Cytoscape (Шеннон и др. 2003) для определения важных терминов GO и описания функций генов. Мы установили значимость обогащения терминов GO путем реализации двустороннего гипергеометрического теста и скорректированных Бенджамини – Хохберга p-значений с использованием статистики ClueGO.

Представляющие интерес гены, связанные с солевым гомеостазом

Для идентификации генов, связанных с солеустойчивостью, мы использовали эталонный геном Suillus brevipes (Branco et al. 2015) из базы данных MycoCosm (Григорьев и др. 2013). Мы провели поиск в базе данных по ключевым словам «Na ⁺ » и «натрий». Количество копий генов было восстановлено с помощью Bedtools (Quinlan 2014), и мы построили тепловые карты, отображающие количество копий генов в R (R Core Team 2014), используя gplots (Warnes et al. 2009) и Rcolorbrewer (Neuwirth 2014).

Мы выполнили точные тесты Фишера (R Core Team 2014), чтобы выяснить, существует ли значительная разница в количестве копий гена, связанного с солевым гомеостазом, между популяциями.Для каждого человека количество копий выбранных генов оценивали как усиление, отсутствие или нейтральность на основе эталонного генома. Точные тесты Фишера были выполнены с ожидаемым отношением шансов 1: 1 и доверительным интервалом 95%. Мы использовали поправку Бонферрони для множественного тестирования. Весь код доступен на https://github.com/abazzical/sbrevCNV.

Результаты

CNV генов не отражают структуру SNP у Suillus brevipes

В отличие от предыдущих результатов SNP, показывающих четкую дифференциацию популяции (Branco et al .2015), не было значительных различий в количестве CNV или размере CNV между горными и прибрежными популяциями (критерий суммы рангов Вилкоксона P > 0,05). Подавляющее большинство CNV были потеряны по всему геному (Таблица 1). Около 10% CNV были локализованы в предполагаемых генах всех изолятов. В соответствии с результатами, полученными на других грибах (Hartmann and Croll, 2017), мы обнаружили гораздо меньшее увеличение числа копий по сравнению с потерями как по геному, так и по прогнозируемым генам. Потери были в среднем гораздо большими участками генома по сравнению с размером дупликаций / умножений (Таблица 1, Рисунок 1).

00000 п. 00000 00000 п. 0000094524 00000 п.