Формы листиков: Основные формы и строение листьев. Сложный лист: строение, описание, примеры

Формы листьев (1) – Наглядный словарь – Copyright © 2005-2016 – Все права защищены.

Фото:

EN: Лист

FR: Feuille

ES: Ходжа

В ботанике лист – это надземное растение. орган, специализирующийся на фотосинтезе. Для этого обычно используют лист. плоский (ламинарный) и тонкий, чтобы обнажить клетки, содержащие хлоропласт освещать большую площадь и позволять свету полностью проникать в ткани.Листья также являются участками большинства растений, где транспирация и имеет место гуттация. Листья могут хранить пищу и воду и видоизменяются. на некоторых заводах для других целей. Сопоставимые структуры папоротников правильно именуются вайями. Кроме того, заметны листья. в рационе человека как листовые овощи.

Структурно полный лист покрытосеменных. состоит из черешка (стебля листа), пластинки (листовой пластинки) и прилистников (небольшие отростки, расположенные по обе стороны от основания черешка).Черешок прикрепляется к стеблю в точке, называемой «пазухой листа». Не все виды производят листья со всеми вышеупомянутыми структурными особенностями. составные части. У некоторых видов парные прилистники неочевидны или не видны. отсутствует вообще. Черешок может отсутствовать, а может не быть лопатки. ламинарный (уплощенный). Огромное разнообразие, показанное в структуре листьев (анатомия) от вида к виду подробно представлена ​​ниже в разделе Морфология листа.По прошествии определенного периода времени (т. Е. Сезонно, во время осень) лиственные деревья сбрасывают листья. Эти листья затем разлагаются в почву. Внешние характеристики листа (такие как форма, край, волосы и т. д.) важны для определения видов растений, а ботаники разработали богатую терминологию для описания характеристик листа. Эти структуры являются частью того, что определяет листья; Они растут и достигните определенного рисунка и формы, а затем остановитесь.Другие части растений стебли или корни не являются определяющими и обычно продолжают расти, пока у них есть для этого ресурсы.

Идентификация растений с использованием формы листьев – подход к подсчету образцов

Д-р Конг Чжао окончил Северо-Западный политехнический университет Китая в 2008 году и получил степень доктора философии. Получил степень в Китайском университете Гонконга в 2012 году. Затем он присоединился к лаборатории изображений и визуальных вычислений Lenovo Research и возглавил группу визуального распознавания.Сейчас он инженер по алгоритмам в DJI. Его исследовательские интересы включают компьютерное зрение, оптимизацию и машинное обучение.

Доктор Сиу-Фонг ЧАН окончил Китайский университет Гонконга со степенью бакалавра наук в области биологии. В настоящее время она работает координатором исследовательского проекта в своем законченном университете, изучает вертикальные системы озеленения с точки зрения их механизма и эффективности использования воды, терморегулирования и углеродного следа. На последнем курсе университета она изучала переработку отходов для выращивания съедобных грибов.Она также интересуется изучением идентификации видов деревьев на основе морфологии листьев.

Доктор Вай-Куен Чам (S ׳77– M ׳79– SM ׳ 91) окончил Китайский университет Гонконга в 1979 году по специальности электроника. Он получил степень магистра наук. и к.т.н. степени Технологического университета Лафборо, Великобритания, в 1980 и 1983 годах соответственно.

С мая 1985 года он работает на факультете электронной техники Китайского университета Гонконга. Его исследовательские интересы включают обработку изображений и кодирование видео.

Доктор Л.М. Чу окончил Ботанический факультет Ливерпульского университета со степенью доктора философии и в настоящее время является адъюнкт-профессором Школы наук о жизни Китайского университета Гонконга. Он имеет более чем 20-летний опыт исследований в прикладной экологии. Он специализируется на восстановительной экологии, городской экологии и загрязнении почвы и воды. Он опубликовал 50 статей, реферируемых на международном уровне, и 4 главы в книгах. В настоящее время он изучает устойчивость и экологию озелененных склонов, а также оценивает вертикальные системы озеленения и их эффективность с точки зрения эффективности использования воды и выбросов углекислого газа.Он также заинтересован в оцифровке живых и консервированных образцов растений для ботанической идентификации и исследований.

Copyright © 2015 Elsevier Ltd. Все права защищены.

Список форм для идентификации листьев

По данным Департамента садоводства штата Орегон, листья являются обычным способом идентификации растений. Листья могут быть широкими или узкими, простыми или сложными, лопастными или зубчатыми. Однако важно отметить одну из более широких деталей: общую форму листа.

Линейный

••• Jupiterimages / Photos.com / Getty Images

У этого листа очень узкая форма с почти параллельными сторонами. Это подходит к концу. В эту группу входят листья мечевидной формы (длинные и игольчатые). Большинство травинок имеют линейную форму. Линейный лист может быть простым; то есть неразделенные только с одним основным разделом.

Ланцетный

••• BananaStock / BananaStock / Getty Images

Этот тип лезвия похож на линейный лист, но шире в центре.Он все еще длиннее, чем широкий, и сужается к концу. Большинство ланцетных листьев сложны и разделены перегородкой в ​​центре. У вечнозеленых растений альпинии ланцетные листья, как и у нарциссов.

Продолговатый

••• Santje09 / iStock / Getty Images

Лист этой формы такой же длины, как и широкий, с параллельными изогнутыми сторонами. Некоторые разновидности омелы имеют продолговатые листья, как и паслен, тростник и мексиканская райская птица.

Elliptic

••• klaikungwon / iStock / Getty Images

Это лезвие принимает форму эллипса.Он шире в центре, и оба его конца сужаются. У обыкновенного растения Calathea eclipse такая форма лезвия.

Яйцевидные

••• lev radin / iStock / Getty Images

У растения с яйцевидными листьями листья яйцевидной формы, которые у основания шире, чем на конце. У магнолий, как правило, пластинки листьев яйцевидной формы, в зависимости от их разновидности. У каркаса также есть яйцевидные листья.

Cordate

••• Giorgio Fochesato / iStock / Getty Images

Сердцевидный сердечник назван так из-за его лезвия в форме сердца.Точка сердца может начинаться вверху или внизу листа. Этот тип листьев имеет цветущее многолетнее растение цикламен.

Reinform

••• Габриэле Мальтинти / iStock / Getty Images

Лист реформирования имеет форму почки. Английское водное растение лягушка может похвастаться такой формой лезвия. Лавандово-голубая герань Maestro также имеет переформированные листья.

Лопатка

••• tdhster / iStock / Getty Images

Эти листья имеют форму лопатки или ложки.Плотоядное растение Drosera intermedia – одно из многих растений с этим типом листьев.

Круглые

••• kumakuma1216 / iStock / Getty Images

Как следует из названия, эти листья полностью круглые. Деревья Myam Asian Maple имеют округлые лезвия. Этот зеленый круглый лист используется для обозначения званий майора и подполковника в армии.

Модификации гена LATE MERISTEM IDENTITY1 ответственны за основные формы листьев хлопчатника Упланд (Gossypium hirsutum L.)

Значение

Листья являются основным источником фотоассимилятов сельскохозяйственных культур. Точное понимание генетической архитектуры, лежащей в основе морфологии листьев, имеет решающее значение для создания климатоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур. Идеальный сорт хлопка даст нижний полог из обычных листьев перед переходом к верхнему пологу из бамии листьев. Здесь мы показываем, что основные формы листьев хлопка контролируются локусом okra , который кодирует фактор транскрипции HD-Zip Gossypium hirsutum LATE MERISTEM IDENTITY1-D1b ( GhLMI1-D1b ).Используя сайленсинг генов, мы временно индуцировали нормальное формирование листьев у окра , тем самым подтверждая ген-кандидат и создавая идеотип формы листа у хлопка. Это исследование, идентифицирующее единственный локус, ответственный за форму листа хлопка, расширяет генетический набор инструментов для селекционеров, чтобы вывести лучшие сорта хлопка.

Abstract

Форма листьев у растений сильно различается. Листья являются основным источником фотоассимилятов сельскохозяйственных культур, и понимание генетической основы изменчивости морфологии листьев имеет решающее значение для повышения продуктивности сельского хозяйства.Форма листа сыграла уникальную роль в улучшении хлопка, поскольку селекционеры выбрали целые и лопастные морфы листьев, полученные из одного локуса, окра ( l -D ₁ ), который отвечает за основные формы листьев в хлопке. Локус l -D ₁ имеет не только сельскохозяйственное значение для хлопка, но благодаря новаторским химерным и морфометрическим исследованиям он внес свой вклад в фундаментальные знания о развитии листьев.Здесь мы показываем, что фактор транскрипции HD-Zip, гомологичный гену LATE MERISTEM IDENTITY1 ( LMI1 ) Arabidopsis , является причинным геном, лежащим в основе локуса l -D ₁ . Классический аллель формы листа окра имеет тандемную дупликацию 133 п.н. в промоторе, что коррелирует с повышенной экспрессией, тогда как делеция 8-п.н. в третьем экзоне предполагаемого нормального аллеля дикого типа вызывает сдвиг рамки считывания и усеченная кодирующая последовательность.Наши результаты показывают, что subokra является предковой формой листа тетраплоидного хлопка, давшего начало аллелю окра , и что нормальный является производным мутантным аллелем, который стал преобладать и определять форму листа культурного хлопка. Вызванное вирусом сайленсинг гена (VIGS) LMI1 -подобного гена у сорта окра было достаточным для индукции нормального образования листьев. Изменения в развитии листьев, связанные с этим геном, связаны с фотосинтетической транскриптомной сигнатурой, что доказывает ее использование селекционерами для получения превосходного идеотипа хлопка.

Форма листа очень разнообразна (1⇓ – 3). Это разнообразие отражает эволюционные процессы – адаптивные или нейтральные – которые проявляются через изменения в программировании развития, пластичность среды или их взаимодействие (4). В качестве основных источников фотоассимиляции основных сельскохозяйственных культур в мире роль листьев – их формы, морфология ограничений, накладываемых на другие физиологически значимые особенности, и вклад формы листьев в структуру полога и растения – независимо от того, были ли они прямо или косвенно выбраны во время одомашнивания. , является бесспорно важным фактором при обсуждении продуктивности сельского хозяйства.Хотя о генетической основе морфологии листьев известно много, только несколько генов, изменяющих форму листьев у сельскохозяйственных культур или ответственных за естественные вариации между видами, были идентифицированы (5-10).

Хлопок ( Gossypium spp.) – важнейший в мире источник натурального волокна, а также ведущая масличная культура. Культурный хлопок ( Gossypium hirsutum и Gossypium barbadense ) – это аллотетраплоидные виды (2n = 4x = 52, AADD), образованные в результате гибридизации диплоидов Gossypium arboreum (2n = 2×1498 Gossypium arboreum (2n = 2x1497i = 26, AA). (2n = 2x = 26, DD) (11).Замечательное фенотипическое разнообразие существует в отношении формы листьев хлопка, широко варьирующееся от целых (без расслоения) до глубоко лопастных как у диплоидов, так и у полиплоидов (12–14). Форма листа у Gossypium является важным агрономическим признаком, который влияет на архитектуру растения и кроны, урожайность, устойчивость к стрессу и другие производственные характеристики (15). Среди сельскохозяйственных культур форма листьев хлопка уникальна; в недавней истории селекционеры использовали единственный локус, окра , для целенаправленного изменения формы листьев среди сортов хлопчатника (15, 16).Четыре основных формы листьев хлопка: нормальный , субокра , окра и суперокра (рис.1 A ) являются полудоминантными и аллеломорфными в области l -D _{1 ( okra ) локус (15⇓⇓⇓⇓⇓ – 21), тогда как laciniate , сходный по морфологии с okra , соответствует ортологическому диплоидному локусу A-генома ( l -A 1 ) (22). Помимо сельского хозяйства, локус окра также имеет историческое значение для развития листьев.Он не только использовался для одного из первых всесторонних морфометрических описаний листьев (12, 23), но и в новаторских исследованиях, в которых были созданы химеры окра, , был определен вклад различных слоев клеток в форму листа (24, 25).}

Морфометрический анализ формы листьев, обусловленный мутациями subokra , okra и superokra . ( A , Left до Right ) Листья представляют собой фенотипы формы листьев нормальных , subokra , окра и superokra .( B ) Собственные листья, представляющие форму листьев, обнаружены ± 3,5 SD вдоль каждой оси главного компонента (PC), рассчитанной из гармонических рядов анализа EFD. ( C ) Предоставляется процентное отклонение, объясненное каждым компьютером. PC1 и PC3 (PC2 не показан, поскольку он объясняет асимметричную вариацию формы) разделяют нормальных и различные окра классов формы листьев. Также представлены эллипсы доверительной вероятности 95%. ( D ) LDA максимизирует различение классов формы листьев нормальных и окра окраски.Показаны LD1 и LD2, и указано процентное разделение между фенотипическими классами листьев. Также представлены эллипсы доверительной вероятности 95%. ( E ) Матрица неточностей, показывающая фактические и предсказанные формы листьев, построенная с использованием линейных дискриминантов. Форма листа сама по себе дискриминирует большинство из нормальных типов листьев субокра, , окра, и суперокрадов. ( F ) СЭМ зачатков листьев SAM, P1 и P2 для нормальных , окра и суперокра верхушек побегов.Обратите внимание на смещенный лепесток в P2 суперокра относительно нормального . ( G ) СЭМ нормальных и окра верхушек побегов показывает более выраженную долю листа, присутствующую на стадии P4 развития зачатка листа у окра по сравнению с нормальным . Цвета, нормальный , красный; окра , синий; субокра , зеленый; суперокра , фиолетовый. [Масштабная линейка, 100 мкм ( F ) и 200 мкм ( G ).]

Аллельная серия окра дает все более лопастную форму листьев от субокра до окра с проксимальными долями зрелой суперокра , уменьшенными до одной линейной пластинки (рис. 1 A ). Характерная форма этих четырех листовых морфов может использоваться как качественно, так и количественно (12, 23), чтобы различать их аллели (рис. 1 B – E ). Классические исследования развития с участием окра показали, что основной фактор действует на ранних этапах развития листа во всех тканевых слоях (L1, L2, L3) и клетке автономно (24, 25).Сканирующие электронные микрофотографии (СЭМ) апикальной меристемы побега показывают, что глубоко лопастный фенотип суперокра проявляется на стадии P2 развития листа (рис.1 F ), тогда как менее тяжелая окра проявляется на стадии P4. ступень (рис.1 G ).

Локус l -D ₁ был помещен на короткое плечо хромосомы 15-D ₁ (Chr15) с помощью цитогенетики (26, 27) и подтвержден картированием локусов количественных признаков (QTL). (28⇓ – 30).Локус l -D ₁ был локализован в интервале 5,4 см около теломеры Chr15 (31), и челночное картирование с использованием гена laciniate ( l -A ₂ ^L ) из G. arboreum дополнительно уменьшил область-кандидат до 112 т.п.н. и 10 генов (22). Картирование и геномное нацеливание указали на два предполагаемых паралогичных гена на Chr15 в качестве возможных генов-кандидатов для локуса -1 -D ₁ (31, 32).Здесь мы сообщаем об идентификации гена LATE MERISTEM IDENTITY1 ( GhLMI1-D1b ), кодирующего фактор транскрипции HD-Zip, в качестве основного детерминанта изменения формы листа на участке l -D ₁ локус из хлопка.

Результаты

Локус

Временная экспрессия 35S :: GhLMI1-D1b ^Okra -GFP и pUBQ10 :: GhLMI1-D1b ^Okra -GFP использовалась для определения Nico в Nico субклеточная локализация GhLMI1-D1b ^Okra . GhLMI1-D1b ^Okra -GFP был обнаружен в ядре трансформированных растений табака ( SI Приложение , рис.S9) в паттерне, который совмещен с ядерным маркером RFP-Histone2B ( SI, приложение , рис. S9). Эксперименты по слиянию белков показали, что GhLMI1-D1b ^Okra -GFP локализован в ядре, что согласуется с классификацией LMI1 -подобных генов как факторов транскрипции (8, 9, 35).

Обсуждение

Форма листа сильно меняется в зависимости от эволюции растения и в зависимости от окружающей среды. Понимание генетической архитектуры формы листьев имеет решающее значение для использования ее вариаций для изменения физиологии растений и повышения агрономической прибыльности (2, 4).Используя разнообразный набор геномных и молекулярных инструментов, мы установили, что мультиаллельный локус основной формы листа l -D ₁ хлопка регулируется GhLMI1-D1b , кодирующим фактор транскрипции HD-Zip.

LMI1 -подобные гены, в частности их дупликация и регуляторная диверсификация, недавно были предложены в качестве горячих точек эволюции для разнообразия формы листьев у модельных растений (8, 9). Представленные здесь данные указывают на то, что основные формы листьев культурного хлопка контролируются одним и тем же путем.Почти тандемная дупликация LMI1 -подобных генов в Gossypium (рис. 2 D ) уникальна от ранее описанных, поскольку Malvales и Brassicales расходились до дупликаций, наблюдаемых у Brassicaceae (8, 9). Следовательно, отдельное событие дупликации LMI1 в Gossypium указывает на конвергентную эволюцию и усиливает доказательства того, что LMI1 -подобные гены являются эволюционными горячими точками для изменения формы листа (8, 9).

Анализ последовательности GhLMI1-D1b в наборе из 20 сортов выявил два основных полиморфизма среди различных форм листьев в локусе l -D ₁ (Рис. 3 C и Приложение SI. , таблицы S2 – S4). Во-первых, делеция длиной 8 п.н. около начала третьего экзона была обнаружена только в нормальном GhLMI1-D1b . Эта делеция приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременному стоп-кодону в предсказанном нормальном белке GhLMI1-D1b , который может мешать функции мотива лейциновой застежки-молнии (рис.5 А ). Кроме того, усечение С-конца может повлиять на стабильность белка, удаляя остатки, необходимые для правильной укладки. Второй косегрегационный полиморфизм представлял собой тандемную дупликацию из 133 п.н. ~ 800 п.н. выше сайта начала трансляции GhLMI1-D1b (фиг. 3 C и SI, приложение , таблица S2). Эта дупликация присутствовала во всех аллелях суперокра и окра , но отсутствовала во всех нормальных аллелях и субокра .Кроме того, экспрессия GhLMI1-D1b была повышена у растений с формами листьев окра и суперокра (фиг. 3 B ). Этот вывод согласуется с предыдущими сообщениями о том, что модификации промоторов LMI1- подобных генов изменяют экспрессию и форму листьев у модельных растений (8, 9). Наконец, подавление GhLMI1-D1b с помощью VIGS в образце хлопка с фенотипом листьев окра сильно уменьшило лопаточность листьев и привело к образованию нормальных листьев (рис.4 А ).

На основании сравнительного анализа последовательностей оказывается, что нормальный произошел от G. raimondii LMI1-D1b (фиг. 5 B ). Из-за их общей делеции 1 п.н., сдвига рамки считывания и преждевременного стоп-кодона этот белок, возможно, уже был нефункциональным или частично. Последующая делеция длиной 8 пар оснований, которая вызывает более ранний сдвиг рамки считывания и преждевременный стоп-кодон, должна, как ожидается, еще больше нарушить функцию белка. Анализ последовательности показал, что другие три аллеля формы листа не являются производными от G.raimondii LMI1-D1b. Этот предковый аллель, возможно, произошел от диплоидного диплоида генома D, хотя, вероятно, не G. thurberi или G. trilobum (рис. 5 B ). После того, как аллель subokra развился в геноме D, он, вероятно, дал начало окра посредством единственной дупликации 133 п.н. в промоторной области. Происхождение этой дупликации промотора в настоящее время неясно, но она могла возникнуть из-за неравного кроссинговера или проскальзывания репликации или из-за мобильных элементов.В соответствии с результатами экспрессии и результатами сайленсинга генов, полученными здесь, эта дупликация промотора привела к сверхэкспрессии GhLMI1-D1b и увеличению степени лопастности и сложности листа. Обнаружение только одного дополнительного промотора SNP во всей генной области GhLMI1-D1b между субокра и окра указывает на то, что это событие произошло относительно недавно. Только два промоторных SNP дифференцируют суперокра от окра (рис.3 C ), что согласуется с информацией о том, что суперокра произошли от окра в течение последних 90 лет (15). Филогенетический анализ с участием последовательностей всех видов Gossypium позволит установить эволюционное и адаптивное значение генов LMI1 хлопка.

Чтобы обратиться к молекулярной основе фенотипа окра , мы сравнили экспрессию генов между окра и нормальными изолиниями BC ₈ с использованием RNA-Seq на стадии развития листа P2 (рис.6 и набор данных S4). Анализ обогащения GO для набора дифференциально экспрессируемых генов показывает, что процессы микротрубочек и кинезина подавляются в бамии по сравнению с нормальными образцами , что предполагает клеточную основу для наблюдаемых изменений в морфологии листа (набор данных S5), тогда как фотосинтез GO категории высоко обогащены окра по сравнению с нормальными образцами ( SI Приложение , рис. S8 и набор данных S6). Это открытие согласуется с предыдущими транскриптомными анализами верхушек побегов томатов, которые выявили положительную корреляцию между экспрессией генов, связанных с фотосинтезом, и генетическими изменениями в сложности листьев (33).Направление этой корреляции одинаково для окра (т.е. экспрессия фотосинтетического гена положительно коррелирует с увеличением рассечения листа), что подразумевает широкую связь между морфологией листа и способностью к фотосинтезу. Предыдущая работа Cardamine hirsuta продемонстрировала, что ПОНИЖЕННАЯ СЛОЖНОСТЬ ( RCO ), гомолог GhLMI1-D1b , способствует расслоению листа путем ингибирования деления клеток в пазухах зачатков молодых листьев (8).Мы не смогли идентифицировать каких-либо сильных кандидатов клеточного цикла из наших анализов дифференциальной экспрессии генов (рис. 6 C ). Одним из возможных объяснений этого несоответствия является то, что репрессия клеточного цикла у okra происходит на более поздней стадии развития или не проявляется через транскриптомные изменения. Среди нашего списка дифференциально экспрессируемых генов развития между окра и нормальными листьями есть несколько предполагаемых регуляторов развития, которые могут быть связаны со сложностью листа, такие как факторы транскрипции, содержащие домен BTB / POZ, содержащие гомеодомен, и факторы транскрипции семейства GRAS.Кроме того, три LOB-гена, которые, как известно, очерчивают границы органов, включая образование долей и зубцов (38), значительно активированы в окра по сравнению с нормальными образцами P2 (Gh_D12G0701, Gh_D05G2414 и Gh_A05G2159). предполагая, что эти гены могут действовать ниже GhLMI1-D1b , формируя паттерн фенотипа окра .

Okra – исключительная мутация, влияющая на развитие листа. Он вдохновил на раннюю количественную основу для определения формы листа в процессе эволюции и развития (12, 23) и, посредством химерных исследований, выявил некоторые взгляды на морфогенетические и клеточные основы морфологии листа (24, 25).В двух отдельных случаях в пределах Brassicaceae гомологи GhLMI1-D1b были вовлечены в эволюционные сдвиги в морфологии листа (8, 9). То, что локус окра обеспечивает моногенную основу для большей части изменчивости формы листьев хлопка, механизмы которой были изучены на других модельных организмах, и что он вовлечен в продуктивность основной культуры, демонстрирует уникальное пересечение между сельским хозяйством. и эволюционные и эволюционные основы морфологии листа.

Материалы и методы

Растительный материал.

Для точного картирования локуса l -D ₁ мы использовали родительские образцы NC05AZ21 и NC11-2100 (TX-2324; PI607650) ( SI Приложение , рис. S10), которые были ранее использовались в предварительном картографическом исследовании (31). Всего 1027 растений F ₂ , полученных от исходного скрещивания окра (NC05AZ21) × нормальное (NC11-2100), использовали для идентификации рекомбинантов для точного картирования локуса -1 -D ₁ .Панель разнообразия из 538 членов использовалась для ассоциативного картирования и полногеномных ассоциативных исследований. Эта панель состояла из 384 членов комиссии по разнообразию хлопка (39), плюс 154 образца диких и староместных сортов, все из которых были получены из коллекции зародышевой плазмы хлопка Министерства сельского хозяйства США (набор данных S1). Два набора изолин использовали для точного картирования и / или в исследованиях экспрессии генов и VIGS, набор BC ₈ , который включал все четыре формы листьев на фоне Stoneville 213 (40), и пара BC ₃ нормальных . и окра на фоне Stoneville 7A (41).

Морфометрический анализ.

Четыре листа каждого образца в панели разнообразия хлопка были взяты с поля на Центральной исследовательской станции сельскохозяйственных культур, Клейтон, Северная Каролина, середина августа 2015 года. Листья были размещены на сканере (Epson Workforce DS-50000) с линейкой , сканировали абаксиальную сторону листа. Файлы были названы в соответствии с порядком их сканирования и дополнены номером поля, соответствующим информации о генотипе. В ImageJ (42) для преобразования листьев в двоичные полированные объекты использовались функции «Сделать двоичным», «Заполнить отверстия», «Открыть», «Закрыть» и «Инвертировать изображение».Затем отдельные бинарные листья были выбраны вручную с помощью инструмента «Жезл», скопированы и вставлены в отдельные файлы, названные по генотипу. Бинарные силуэты листьев были преобразованы в цепной код с помощью программы SHAPE (43, 44). Затем файл кода nef из SHAPE (файл .nef) был импортирован в пакет Momocs в R (45⇓⇓ – 48) с помощью функции NEF2COE. Индивидуальным контурам листьев в объекте Coe были присвоены уровни фенотипического фактора нормальных , субокра , окра и суперокра и выделенных гармоник для последующего анализа.Функции PC.contrib () и pca () в Momocs использовались для визуализации собственных листьев и выполнения PCA (соответственно) на гармониках, а функция morpho.space () использовалась для визуализации морфопространства (47). LDA для гармонических коэффициентов выполнялась с использованием функции lda в сочетании с пакетом MASS (49). Функция прогнозирования (пакет статистики) и табличная функция (базовый пакет) использовались для перераспределения листьев по их предсказанному фенотипическому классу. Пакет R ggplot2 (50) использовался для всех визуализаций данных, если не указано иное.

Cryo-SEM SEMs Okra и WT.

Для сравнения P2 верхушки вегетативных побегов были вручную препарированы из 4-недельных нормальных , окра и суперокра BC ₈ изолин (40), чтобы обнажить апикальную меристему побега и две наиболее недавно инициированные зачатки листьев: P1 и P2. Апексы прикрепляли к шлейфам SEM с помощью криоклея, замораживали в жидком азоте и просматривали с помощью настольного сканирующего электронного микроскопа Hitachi TM-1000. Регулировка контрастности изображения и добавление шкалы были выполнены на Фиджи (fiji.sc /).

Сопоставление ассоциаций.

Популяция ассоциативного картирования состояла из 384 членов группы элитного разнообразия хлопка (39) и 154 диких и староместных образцов тетраплоидного хлопка, некоторые из которых были чувствительны к условиям фотопериода длинного дня. Из этой популяции панель разнообразия из 447 нечувствительных к фотопериоду линий была выращена в летних полевых условиях в Клейтоне, Северная Каролина, тогда как 91 чувствительный к фотопериоду образец выращивали в 10-дюймовых одиночных горшках в теплице в условиях короткого дня.Все растения были фенотипированы, как описано ранее (31).

Всего было сконструировано 47 маркеров STS из области-кандидата из 10 генов (фиг. 2 C ). Три были полиморфными и запускались на панели сопоставления ассоциаций. Кроме того, два SNP были преобразованы в анализ конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP) и проанализированы на популяции в Восточной региональной лаборатории генотипирования мелкого зерна. Положения маркеров приведены в Приложении SI , Рис. S1, а последовательности праймеров представлены в Приложении SI , Таблица S5.Выделение ДНК и генотипирование с использованием SSR и маркеров STS выполняли, как описано ранее (31). Все пары праймеров были синтезированы Integrated DNA Technologies.

Чтобы убедиться, что ассоциации между формой листа и тестируемыми генами-кандидатами не были обусловлены структурой популяции, 149 мультиаллельных SSR-маркеров, распределенных по всему геному, также были проанализированы на панели разнообразия из 384 строк, а также 42 дополнительных линии с форма листа окра из большего набора, протестированного выше.Многоаллельные SSR-генотипы были преобразованы в числовые оценки содержания аллелей (0, 1 или 2) с использованием опции «Расширить мультиаллельные генотипы» в JMP Genomics версии 8 (Институт SAS). PCA использовался для оценки структуры населения панели разнообразия. После первоначального анализа структуры популяции стало ясно, что 17 диких образцов представляют собой отдельные выбросы по оси первого главного компонента (что составляет 23% вариации маркера). Кроме того, только одна линия демонстрировала фенотип субокра , а одна линия демонстрировала фенотип субокра .Дикие образцы и типы sub- и superokra были исключены из дальнейшего анализа ассоциации, в результате чего 54 маркера SSR оказались мономорфными в оставшейся выборке линий. Эти SSR были исключены из дальнейшего анализа, и PCA был выполнен снова на оставшейся выборке из 404 линий и 95 маркеров SSR, которые включали 36 бамии типов и 368 нормальных типов листьев.

Затем все маркеры были протестированы на ассоциацию с бинарным признаком окра по сравнению с нормальной формой листа с использованием модели логистической регрессии в процедуре PROC LOGISTIC в программном обеспечении SAS версии 9.4 (Институт САС). Структура популяции контролировалась включением первых трех основных компонентов (объясняющих 9% вариации профилей маркеров) в качестве ковариат в модели. Чтобы иметь дело с полным и квазиполным разделением, наблюдаемым в некоторых маркерах, мы использовали опцию FIRTH, доступную в программном обеспечении SAS, которая производит оценки конечных параметров посредством оценки максимального правдоподобия со штрафными санкциями (51).

При первоначальном сканировании несколько маркеров области гена-кандидата и несколько SSR имели значительные ассоциации с формой листа.Изучение данных маркеров выявило, что генотипы в значимых SSR коррелировали с генотипами маркеров области гена-кандидата. Поэтому мы выполнили второе сканирование всех маркеров SSR, в которое наиболее значимый вариант гена-кандидата (GhLS-STS1) был включен в качестве дополнительной ковариаты в модель.

Полуколичественный экспресс-анализ.

Суммарная РНК была собрана с трех выращенных в поле растений [ n (количество повторений) = 3] каждого из шести сортов: NC05AZ21 ( окра ), NC11-2100 ( нормальный ), LA213-63 ( нормальный рекуррентный родитель), LA213 Sea Island Leaf ( subokra ), LA213 okra и LA213 superokra .Образцы отбирали через ~ 90 дней после посадки. Листья забирали как можно раньше, их можно было надежно отличить от апикальной меристемы побега без помощи какого-либо оборудования. К этому моменту длина листьев от кончика до основания составляла ~ 30–50 мм.

выделяли с использованием набора Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Общая РНК была преобразована в кДНК с использованием системы обратной транскрипции ImProm-II (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.кДНК затем использовали в качестве матрицы в реакциях ПЦР на 50 мкл и визуализировали на 3% (мас. / об.) HiRes агарозе (GeneMate BioExpress). ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА ( GAPDH ) использовали в качестве контрольного гена. Праймеры, используемые в полуколичественном анализе экспрессии, приведены в приложении SI , таблица S6.

Количественный ПЦР-анализ в реальном времени экспрессии

кДНК из изолин LA213 в предыдущем разделе использовали в реакциях кПЦР в режиме реального времени объемом 25 мкл с Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).( ^–ΔΔCt )] (53) и их SD были построены с использованием Microsoft Excel. Непарные t тестов были рассчитаны между изолиниями или экспериментальными обработками VIGS для выявления значительных изменений в экспрессии генов. Праймеры, используемые в RT-qPCR, представлены в приложении SI , таблица S6.

Секвенирование

использовали для получения последовательности геномной ДНК GhLMI1-D1a и GhLMI1-D1b в 20 различных образцах тетраплоида Gossypium , перечисленных в приложении SI, приложение , таблица S4.Секвенирование было выполнено в лаборатории геномных наук Университета Северной Каролины. Специфичные для генома праймеры для ПЦР были разработаны путем выравнивания гомеологических последовательностей из G. raimondii и G. arboreum и выявления различий между двумя донорскими диплоидными геномами ( SI Приложение , Таблицы S6 – S8). Геномная специфичность праймеров была подтверждена путем анализа амплификации в панели диплоидных видов из обоих геномов ( SI Приложение , Таблица S9).Вложенная ПЦР была необходима для 5′-конца GhLMI1-D1a . Полный список праймеров, используемых для секвенирования по Сэнгеру, можно найти в приложении SI , таблица S10. Результаты секвенирования были проанализированы и собраны с использованием Sequencher 5.2.3 (генные коды) с дополнительным выравниванием, выполненным с использованием множественного выравнивания последовательностей Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/). Общедоступные прогнозы для Gorai.002G244200 и Gorai.002G244000 (Phytozome, https: // phytozome.jgi.doe.gov/) были использованы для определения структуры экзон / интрон GhLMI1 -подобных генов с расширениями до стоп-кодона при необходимости. Перевод белков выполнялся с помощью ExPASy Translate Tool (web.expasy.org/translate/). Отрисовки генов, подобных GhLMI1- , были отрисованы с помощью fancyGENE (bio.ieo.eu/fancygene/) и перерисованы в масштабе в Microsoft PowerPoint.

VIGS

Все ферменты, используемые при конструировании векторов сайленсинга TRV, были предоставлены New England Biolabs.Комплекты с названием «Zymo» были предоставлены Zymo Research. Для конструирования TRV2: GhLMI1-D1b фрагмент гена GhLMI1-D1b длиной 461 п.н. амплифицировали из кДНК, полученной из LA213 Okra . Этот фрагмент сайленсинга длиной 461 п.н. GhLMI1-D1b включал последние 29 п.н. второго экзона, целые 239 п.н. третьего экзона и первые 193 п.н. предлагаемого 3′-UTR. Этот фрагмент вместе с вектором pYL156 (TRV2) (полученным из Центра биологических ресурсов Arabidopsis ) затем расщепляли рестрикционным ферментом Acc65I в течение ночи в соответствии с инструкциями производителя.После переваривания рестрикционный фермент инактивировали, помещая реакционные смеси при 65 ° C на 20 минут. Затем расщепленную векторную ДНК дефосфорилировали антарктической фосфатазой в соответствии с инструкциями производителя. Как расщепленный вектор, так и фрагмент GhLMI1-D1b разделяли на 0,8% агарозном геле, вырезали и очищали с использованием набора для восстановления ДНК Zymoclean Gel DNA Recovery Kit и лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4. В сочетании с вектором TRV1 двудольной системы TRV VIGS это лечение было названо TRV: GhLMI1-D1b.

В дополнение к экспериментальной обработке TRV: GhLMI1-D1b , как и раньше, использовали два отрицательных контроля (54). TRV: Mock состоял только из пустого вектора TRV2, который не поддерживает распространение инфекции из-за отсутствия TRV1 и, таким образом, контролирует эффекты процесса инокуляции. TRV: GFP , состоящий из TRV1 плюс TRV2, содержащий фрагмент сайленсинга для GFP , способен распространяться по растению. Однако у хлопка отсутствует эндогенный ген GFP , поэтому можно было только отслеживать потенциальные эффекты инфекции.Поскольку подавление TRV может колебаться во времени (37), а TRV VIGS очень чувствителен к температуре и влажности (36), обработка TRV: CHLI , которая блокирует выработку хлорофилла, использовалась в качестве видимого маркера, чтобы гарантировать, что условия окружающей среды подходят для VIGS и время фенотипирования нокдаунов LMI .

Две контрольные конструкции VIGS, TRV: GFP и TRV: ChlI, были получены путем расщепления плазмиды TRV2 pYL156 с помощью Acc 65I. Концы переваренного вектора притупляли с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы I (Кленова) и дефосфорилировали антарктической фосфатазой.Фрагмент GFP длиной 499 п.н., фланкированный сайтами рестрикции StuI, амплифицировали из трансгенного хлопка, несущего трансген mGFP5-ER (55), с использованием праймеров mGFPerF: 5′-ATA AGG CCT GTG ATG CAA CAT ACG GAA AAC-3 ‘ и mGFPerR2: 5’-ATT AGG CCT AGG TAA TGG TTG TCT GGT AAA AG-3 ‘. Продукты ПЦР GFP обессоливали с использованием набора Zymo DNA Clean and Concentrator. Затем очищенный продукт ПЦР расщепляли StuI. Фрагмент с тупым концом длиной 501 п.н. гена хлопка ChlI расщепляли из pJRT.CLCrVA.009 (55) с использованием Msc I, очищенного в геле и экстрагированного из агарозного геля с использованием набора для восстановления ДНК Zymoclean Gel DNA Recovery Kit. Фрагменты гена GFP и ChlI с тупыми концами лигировали в вектор TRV2 с использованием ДНК-лигазы Т4.

Все векторные конструкции трансформировали в компетентные клетки Dh20-бета (New England Biolabs) и высевали на чашки с агаром Луриа-Бертани, содержащие по 50 мкг / мл канамицина и гентамицина. Трансформанты проверяли на направление вставки с использованием следующих праймеров: TRV2MCSF, 5′-CTT AGA TTC TGT GAG TAA GGT TAC C-3 ‘и mGFPerR2, 5’ ATT AGG CCT AGG TAA TGG TTG CT GGT AAA AG 3 ‘для TRVGFP; и TRV2MCSF, 5’-CTT AGA TTC TGT GAG TAA GGT TAC C-3 ‘и GhChlIR, 5′-GCT TGG CCA ATC AAA CCG TGC TCT TT-3’ для TRVChlI.Положительные клоны были подтверждены секвенированием.

Двухнедельные проростки окра агроинокулировали, как описано ранее (56). В каждой экспериментальной повторности пять растений инокулировали на обработку TRV: Mock, TRV: GFP и TRV: GhLMI1-D1b . Кроме того, по меньшей мере два растения в каждой повторности инокулировали TRV: CHLI . Растения выращивали при цикле день / ночь 26/22 ° C. Начиная с 3 недель после инокуляции, все растения фотографировали еженедельно.Через 4 недели после инокуляции листья случайно собирали с трех из пяти растений ( n = 3) в TRV: GhLMI1-D1b , TRV: GFP и TRV: имитация обработки для анализа экспрессии, как описано выше. Были выполнены три экспериментальных повтора экспериментов VIGS с согласованными результатами. Все праймеры, использованные в эксперименте VIGS, перечислены в приложении SI , таблица S6.

Сравнительный анализ последовательностей

В дополнение к секвенированию GhLMI1- подобных генов в тетраплоидном хлопке, LMI1-D1b секвенировали в диплоидных видах d-генома с долями G. thurberi (PIs 530766 PI и 530789) и G. trilobum ). Последовательности LMI1-A1b и LMI1-D1b , полученные из G. arboreum и G. raimondii , соответственно, были получены с https://www.cottongen.org/. Выравнивание и сравнительный анализ последовательностей выполняли с использованием Clustal Omega.Прогнозирование спирали-поворота-спирали выполнялось с использованием https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/primanal_hth.pl. Лейциновая молния была предсказана с помощью 2zip.molgen.mpg.de/.

GhLMI1-D1b кДНК, выделенную из родительской популяции NC05AZ21 для картирования листьев бамии, секвенировали с помощью секвенирования по Сэнгеру, как описано ранее. Анализ, сборка и выравнивание последовательности были такими, как описано ранее для геномного секвенирования генов, подобных LMI1-. Экстракция РНК и преобразование в кДНК описаны в Semiquantitative Expression Analysis .Сопоставление последовательности кДНК с последовательностью гДНК подтвердило предсказанную структуру экзона / интрона.

Анализ транскриптома RNA-Seq.

Сбор образцов и подготовка РНК для RNA-seq.

Три биологические копии P2, соответствующие листу 8, препарировали вручную непосредственно в ледяной ацетон из нормальных верхушек побегов и окра . Для каждой биологической повторности объединяли по десять человек. Ацетон удаляли из образцов и заменяли буфером для экстракции из набора для выделения РНК PicoPure (ThermoFisher Scientific).РНК выделяли в соответствии с протоколом производителя с дополнительной обработкой ДНКазой на колонке. Целостность РНК оценивали, обрабатывая образцы на чипе Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Набор для синтеза кДНК Clontech SMARTer (Clontech) использовали для амплификации 10 нг общей РНК в дскДНК, обогащенную полиА-хвостом. Всего 150 нг дскДНК фрагментировали в течение 17 мин с помощью фрагментазы (New England Biolabs) и обрабатывали в библиотеках секвенирования Illumina с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra для Illumina (New England Biolabs).Библиотеки Illumina количественно оценивали с помощью Nanodrop и объединяли до конечной концентрации 20 нМ. Объединенные библиотеки секвенировали для односторонних чтений длиной 100 пар оснований на Illumina HiSEq. 2500 в Вашингтонском университете в Центре доступа к технологии генома школы медицины Сент-Луиса (https://gtac.wustl.edu/).

Биоинформатическая обработка данных RNA-seq.

Адаптеры Illumina и низкокачественные основания были обрезаны с помощью Trimmomatic (57) со следующими параметрами по умолчанию: LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4:15 MINLEN: 36.Обрезанные чтения были сопоставлены с геномом G. hirsutum AD1_NBI и с геномом G. raimondii (D5) BGI-CGP v1.0 (https://www.cottongen.org/data/download/genome) (58 , 59) для создания файлов Sequence Alignment / Map (SAM) с использованием программного обеспечения для выравнивания HISAT2 (60) со следующей опцией выравнивания: –dta-cufflinks. Файлы SAM были преобразованы в сжатые и отсортированные файлы двоичного выравнивания / карты (BAM) с помощью команд Samtools –view, -bSh и -sort-sort соответственно (samtools.sourceforge.сеть /) (61). Сопоставление чтения с аннотированными генами для геномов AD1_NBI и D5 BGI-CGP было извлечено с помощью StringTie (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/) (62). Гены с менее чем одним числом на миллион по крайней мере в трех образцах были исключены из анализа. Значительно дифференциально экспрессируемые гены (скорректированное значение FDR P ≤ 0,05) были идентифицированы путем попарного сравнения между нормальными образцами и okra P2 в edgeR версии 3.0 (https: // bioconductor.org / packages / 3.0 / bioc / html / edgeR.html) (63, 64).

ГО обогащения.

R-пакет TopGO (65) был использован для тестирования обогащения категории GO дифференциально экспрессируемыми генами между окра и нормальными транскриптомами P2. Точный тест Фишера (значение P ≤ 0,05) был использован для идентификации значительно обогащенных категорий GO в наборах генов, которые значительно различаются между окра и нормальными образцами P2.

Совместная локализация GhLMI1-D1b

Флуоресцентные слитые белки GhLMI1-D1b были получены путем клонирования Gateway (Life Technologies). GhLMI1-D1b ^Okra CDS без STOP-кодона был амплифицирован из кДНК okra с использованием праймеров GhLMI1-D1b-Okra -TOPO-F (5MIT-CACCATG14GATGACBCCGG и 9MTT-CACCATG14GATGACBCCGG и 9MTTGATGATGACCh -Okra -STOP-R (5′-GGGATAAGAAGGGAGTTGAA-3 ‘) и клонировали в pENTR / D / TOPO (Life Technologies) для создания pENTR :: GhLMI1-D1b-Okra -stop.Рекомбинацию с LR-клоназой (Invitrogen) проводили между pENTR :: GhLMI1-D1b-Okra -stop и следующими векторами-получателями: pGWB5 (66), pGWB8 (66) и pUBQ10-C-GFP. pUBQ10-C-GFP представляет собой модифицированную версию pUBC-GFP (67), но включает полный промотор pUBQ10. Следующие конструкции были получены и подтверждены секвенированием: 35S :: GhLMI1-D1b-GFP и pUBQ10 :: GhLMI1-D1b-GFP. Обе конструкции были введены путем временной трансформации Agrobacterium в растений N. benthamiana , несущих маркер RFP-Histone2B (68), для анализа колокализации.

Конфокальный микроскоп Zeiss LSM 710 с водным объективом 40x (1.1 N.A.) использовался для получения изображения слияния флуоресцентных белков. Длины волн возбуждения / излучения во время сбора данных составляли 488 нм / 492–570 нм для GFP и 561 нм / 588–696 нм для RFP.

Благодарности

Мы ценим техническую помощь Джареда Смита и Шэрон Уильямсон из Министерства сельского хозяйства США и Службы сельскохозяйственных исследований и Кэти Херринг из Министерства сельского хозяйства Северной Каролины, а также докторов.Ричарду Перси и Джеймсу Фрелиховски из Национальной коллекции зародышевой плазмы хлопка Министерства сельского хозяйства США за предоставленные образцы хлопка, использованные в этом исследовании. Cotton Incorporated поддержала эту работу посредством основного финансирования и программы стипендий для докторов наук. За дополнительную поддержку этого исследования мы благодарим Ассоциацию производителей хлопка Северной Каролины и Национальный научный фонд за гранты IOS-1238014 (для J.B.H.) и IOS-1025947 (для C.H.H.).

Сноски

• Автор: В.